Biochemistry · 8/2

血清総ビリルビン・直接ビリルビンの測定

Determination of total and direct serum bilirubin — P II

前提：正常: ヘムの生合成と分解；鉄の恒常性
検査値: ビリルビン

🧠 ビリルビン測定は「Jendrassik-Gróf法：ジアゾ化スルファニル酸diazotized sulfanilic acidジアゾ化スルファニル酸（diazotized sulfanilic acid）diazotized sulfanilic acid（ジアゾ化スルファニル酸）とビリルビンを反応させ青色アゾ色素を作る」原理で読む。抱合型（直接）ビリルビンはカフェインcaffeineカフェイン（caffeine）caffeine（カフェイン）なしでも反応するので「直接」、非抱合型unconjugated非抱合型（unconjugated）unconjugated（非抱合型）（間接）ビリルビンは促進剤accelerator促進剤（accelerator）accelerator（促進剤）（カフェインcaffeineカフェイン（caffeine）caffeine（カフェイン））で親水性hydrophilic親水性（hydrophilic）hydrophilic（親水性）にしてから反応させる必要があるので「間接」——この試薬設計の違いが両分画を分別測定する鍵。

ビリルビン代謝の復習

赤血球の寿命は約120日。ヘムオキシゲナーゼheme oxygenaseヘムオキシゲナーゼ（heme oxygenase）heme oxygenase（ヘムオキシゲナーゼ）がヘムのメテニル架橋methenyl bridgeメテニル架橋（methenyl bridge）methenyl bridge（メテニル架橋）を酸化しCOを放出しながらビリベルジンbiliverdinビリベルジン（biliverdin）biliverdin（ビリベルジン）を生成、ビリベルジン還元酵素biliverdin reductaseビリベルジン還元酵素（biliverdin reductase）biliverdin reductase（ビリベルジン還元酵素）がビリベルジンbiliverdinビリベルジン（biliverdin）biliverdin（ビリベルジン）をビリルビンに変換する。ビリルビンは単結合まわりの回転で分子内水素結合intramolecular hydrogen bond分子内水素結合（intramolecular hydrogen bond）intramolecular hydrogen bond（分子内水素結合）を作り、Z,Z配置をとる——分子表面全体が疎水性になり、血中ではアルブミンに結合して運ばれる（非抱合型unconjugated非抱合型（unconjugated）unconjugated（非抱合型）/間接ビリルビンindirect bilirubin間接ビリルビン（indirect bilirubin）indirect bilirubin（間接ビリルビン））。肝でUDP-グルクロン酸転移酵素UDP-glucuronosyltransferase, UGTUDP-グルクロン酸転移酵素（UDP-glucuronosyltransferase, UGT）UDP-glucuronosyltransferase, UGT（UDP-グルクロン酸転移酵素）が抱合すると水溶性の抱合型/直接ビリルビンdirect bilirubin直接ビリルビン（direct bilirubin）direct bilirubin（直接ビリルビン）になり、胆汁中へ能動輸送される。

💡 新生児の生理的黄疸physiological jaundice生理的黄疸（physiological jaundice）physiological jaundice（生理的黄疸）と光線療法phototherapy光線療法（phototherapy）phototherapy（光線療法）。出生後は肝のUDP-グルクロン酸転移酵素UDP-glucuronosyltransferase, UGTUDP-グルクロン酸転移酵素（UDP-glucuronosyltransferase, UGT）UDP-glucuronosyltransferase, UGT（UDP-グルクロン酸転移酵素）活性が不十分なことが多く、大量に産生されるビリルビンを抱合しきれない。疎水性の非抱合型ビリルビンUnconjugated bilirubin非抱合型ビリルビン（Unconjugated bilirubin）Unconjugated bilirubin（非抱合型ビリルビン）は血液脳関門を通過し核黄疸kernicterus核黄疸（kernicterus）kernicterus（核黄疸）を含む重篤な神経症状を起こしうる。460–490 nmの青色光により、平衡がZ,E配置（親水性hydrophilic親水性（hydrophilic）hydrophilic（親水性）で神経毒neurotoxin神経毒（neurotoxin）neurotoxin（神経毒）性〈neurotoxicity〉がない）へ移動することを利用した光線療法phototherapy光線療法（phototherapy）phototherapy（光線療法）で治療する。これらの酵素誘導enzyme induction酵素誘導（enzyme induction）enzyme induction（酵素誘導）自体は、かつてフェノバルビタールphenobarbitalフェノバルビタール（phenobarbital）phenobarbital（フェノバルビタール）など薬物で促進する治療も行われていた。

ビリルビンの分画と臨床的意義

肝が損傷すると血中の「直接・間接ビリルビンindirect bilirubin間接ビリルビン（indirect bilirubin）indirect bilirubin（間接ビリルビン）」両方が上昇する（肝炎〈hepatitis〉・肝硬変〈cirrhosis〉・特定の真菌毒素〈mycotoxin〉など）。溶血性貧血では「間接ビリルビンindirect bilirubin間接ビリルビン（indirect bilirubin）indirect bilirubin（間接ビリルビン）」が上昇する。閉塞性黄疸obstructive jaundice閉塞性黄疸（obstructive jaundice）obstructive jaundice（閉塞性黄疸）（膵頭部癌carcinoma of the pancreatic head膵頭部癌（carcinoma of the pancreatic head）carcinoma of the pancreatic head（膵頭部癌）〈pancreatic head carcinoma〉・胆石〈gallstone〉など）では「直接ビリルビンdirect bilirubin直接ビリルビン（direct bilirubin）direct bilirubin（直接ビリルビン）」が上昇し、尿・便中にウロビリノーゲンurobilinogenウロビリノーゲン（urobilinogen）urobilinogen（ウロビリノーゲン）が検出されなくなる。

測定原理：Jendrassik-Gróf法

酸性条件下、カフェインcaffeineカフェイン（caffeine）caffeine（カフェイン）存在下で、総ビリルビンtotal bilirubin総ビリルビン（total bilirubin）total bilirubin（総ビリルビン）がジアゾ化スルファニル酸diazotized sulfanilic acidジアゾ化スルファニル酸（diazotized sulfanilic acid）diazotized sulfanilic acid（ジアゾ化スルファニル酸）と反応して青色のアゾ色素を形成する。抱合型ビリルビンconjugated bilirubin抱合型ビリルビン（conjugated bilirubin）conjugated bilirubin（抱合型ビリルビン）分画はカフェインcaffeineカフェイン（caffeine）caffeine（カフェイン）なしでも反応するため、この分画を「直接ビリルビンdirect bilirubin直接ビリルビン（direct bilirubin）direct bilirubin（直接ビリルビン）」と呼ぶ。578 nmでの吸光度absorbance吸光度（absorbance）absorbance（吸光度）がビリルビン濃度に比例する。

試薬化学

主成分main component主成分（main component）main component（主成分）はスルファニル酸sulfanilic acidスルファニル酸（sulfanilic acid）sulfanilic acid（スルファニル酸）（4-アミノベンゼンBenzeneベンゼン（Benzene）Benzene（ベンゼン）スルホン酸sulfonic acidスルホン酸（sulfonic acid）sulfonic acid（スルホン酸））。強酸性（HCl存在下）で亜硝酸イオンnitrite ion亜硝酸イオン（nitrite ion）nitrite ion（亜硝酸イオン）とともに用いると、スルファニル酸sulfanilic acidスルファニル酸（sulfanilic acid）sulfanilic acid（スルファニル酸）はジアゾ-ベンゼンBenzeneベンゼン（Benzene）Benzene（ベンゼン）-パラ-スルホン酸sulfonic acidスルホン酸（sulfonic acid）sulfonic acid（スルホン酸）（diazobenzenesulfonic acid、作動試薬）に変わる。これがUDP-グルクロン酸抱合glucuronidationグルクロン酸抱合（glucuronidation）glucuronidation（グルクロン酸抱合）ビリルビン（直接ビリルビンdirect bilirubin直接ビリルビン（direct bilirubin）direct bilirubin（直接ビリルビン））とアゾカップリング反応azo coupling reactionアゾカップリング反応（azo coupling reaction）azo coupling reaction（アゾカップリング反応）してアゾビリルビンを形成し、強酸性下で青色を呈する。

💡 間接ビリルビンindirect bilirubin間接ビリルビン（indirect bilirubin）indirect bilirubin（間接ビリルビン）は「促進剤accelerator促進剤（accelerator）accelerator（促進剤）」で水溶性にしてから反応させる。間接ビリルビンindirect bilirubin間接ビリルビン（indirect bilirubin）indirect bilirubin（間接ビリルビン）をこの方法で定量するには、アゾカップリング反応azo coupling reactionアゾカップリング反応（azo coupling reaction）azo coupling reaction（アゾカップリング反応）が起こる前に水溶性構造へ変換し、反応を阻害する基を除去する必要がある。カフェイン安息香酸ナトリウムsodium caffeine benzoateカフェイン安息香酸ナトリウム（sodium caffeine benzoate）sodium caffeine benzoate（カフェイン安息香酸ナトリウム）などの促進剤accelerator促進剤（accelerator）accelerator（促進剤）がこの役割を果たす。

flowchart TD
  A["血清試料"]
  A --> B["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='total bilirubin'>総ビリルビン</span>測定（T-B試薬：<span class='jp-term jp-term-diagram' title='caffeine'>カフェイン</span>含む）"]
  B --> C["直接（抱合型）＋間接（<span class='jp-term jp-term-diagram' title='caffeine'>カフェイン</span>で<span class='jp-term jp-term-diagram' title='solubilization'>可溶化</span>された<span class='jp-term jp-term-diagram' title='unconjugated'>非抱合型</span>）両方が反応"]
  A --> D["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='direct bilirubin'>直接ビリルビン</span>測定（D-B試薬：<span class='jp-term jp-term-diagram' title='caffeine'>カフェイン</span>なし）"]
  D --> E["抱合型（直接）ビリルビンのみが反応"]
  C --> F["578 nmで<span class='jp-term jp-term-diagram' title='absorbance'>吸光度</span>測定 → <span class='jp-term jp-term-diagram' title='total bilirubin'>総ビリルビン</span>濃度"]
  E --> G["578 nmで<span class='jp-term jp-term-diagram' title='absorbance'>吸光度</span>測定 → <span class='jp-term jp-term-diagram' title='direct bilirubin'>直接ビリルビン</span>濃度"]
  F --> H["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='indirect bilirubin'>間接ビリルビン</span> = <span class='jp-term jp-term-diagram' title='total bilirubin'>総ビリルビン</span> − <span class='jp-term jp-term-diagram' title='direct bilirubin'>直接ビリルビン</span>"]
  G --> H

実験手順

総ビリルビン測定（T-B試薬）

試薬成分	濃度
スルファニル酸sulfanilic acidスルファニル酸（sulfanilic acid）sulfanilic acid（スルファニル酸）	10.0 mmol/L
塩酸hydrochloric acid (HCl)塩酸（hydrochloric acid (HCl)）hydrochloric acid (HCl)（塩酸）	0.3 mol/L
クエン酸	1.0 mol/L
カフェインcaffeineカフェイン（caffeine）caffeine（カフェイン）	0.5 mol/L
亜硝酸ナトリウムsodium nitrite亜硝酸ナトリウム（sodium nitrite）sodium nitrite（亜硝酸ナトリウム）	2.3 mmol/L
界面活性剤surfactant界面活性剤（surfactant）surfactant（界面活性剤）	—

直接ビリルビン測定（D-B試薬）

試薬成分	濃度
スルファニル酸sulfanilic acidスルファニル酸（sulfanilic acid）sulfanilic acid（スルファニル酸）	30.0 mmol/L
塩酸hydrochloric acid (HCl)塩酸（hydrochloric acid (HCl)）hydrochloric acid (HCl)（塩酸）	0.3 mol/L
クエン酸	1.0 mol/L
亜硝酸ナトリウムsodium nitrite亜硝酸ナトリウム（sodium nitrite）sodium nitrite（亜硝酸ナトリウム）	0.5 mmol/L
界面活性剤surfactant界面活性剤（surfactant）surfactant（界面活性剤）	—
（カフェインcaffeineカフェイン（caffeine）caffeine（カフェイン）を含まない）	—

いずれも、標準液・試料（各50 µL）に作動試薬（1.0 mL）を加え、37°Cで5分間インキュベート後、578 nmでチューブtubeチューブ（tube）tube（チューブ）1（蒸留水対照、distilled water blank）に対する吸光度absorbance吸光度（absorbance）absorbance（吸光度）を測定する。

濃度計算

c_{sample} = \frac{A_{sample}}{A_{standard}} \times c_{standard}

標準液	標準濃度の目安
Standard-T（総ビリルビンtotal bilirubin総ビリルビン（total bilirubin）total bilirubin（総ビリルビン））	27 µmol/L
Standard-D（直接ビリルビンdirect bilirubin直接ビリルビン（direct bilirubin）direct bilirubin（直接ビリルビン））	12 µmol/L

（正確な標準濃度は製造ロットにより異なり、実習開始時に確定される。）

基準範囲

項目	基準値baseline / reference value基準値（baseline / reference value）baseline / reference value（基準値）
総ビリルビンtotal bilirubin総ビリルビン（total bilirubin）total bilirubin（総ビリルビン）	<21 µmol/L
直接ビリルビンdirect bilirubin直接ビリルビン（direct bilirubin）direct bilirubin（直接ビリルビン）	<5.5 µmol/L

まとめ

ビリルビンはZ,Z配置で疎水性、アルブミン結合albumin bindingアルブミン結合（albumin binding）albumin binding（アルブミン結合）の非抱合型unconjugated非抱合型（unconjugated）unconjugated（非抱合型）（間接）として血中を運ばれ、肝でグルクロン酸抱合glucuronidationグルクロン酸抱合（glucuronidation）glucuronidation（グルクロン酸抱合）され水溶性の直接ビリルビンdirect bilirubin直接ビリルビン（direct bilirubin）direct bilirubin（直接ビリルビン）になる。
Jendrassik-Gróf法はジアゾ化スルファニル酸diazotized sulfanilic acidジアゾ化スルファニル酸（diazotized sulfanilic acid）diazotized sulfanilic acid（ジアゾ化スルファニル酸）とのアゾカップリング反応azo coupling reactionアゾカップリング反応（azo coupling reaction）azo coupling reaction（アゾカップリング反応）（青色発色、578 nm）を原理とする。
抱合型（直接）ビリルビンはカフェインcaffeineカフェイン（caffeine）caffeine（カフェイン）なしでも反応するため「直接」と呼ばれる。間接ビリルビンindirect bilirubin間接ビリルビン（indirect bilirubin）indirect bilirubin（間接ビリルビン）は促進剤accelerator促進剤（accelerator）accelerator（促進剤）（カフェインcaffeineカフェイン（caffeine）caffeine（カフェイン））で可溶化solubilization可溶化（solubilization）solubilization（可溶化）して初めて反応する。
T-B試薬（カフェインcaffeineカフェイン（caffeine）caffeine（カフェイン）含む）で総ビリルビンtotal bilirubin総ビリルビン（total bilirubin）total bilirubin（総ビリルビン）、D-B試薬（カフェインcaffeineカフェイン（caffeine）caffeine（カフェイン）なし）で直接ビリルビンdirect bilirubin直接ビリルビン（direct bilirubin）direct bilirubin（直接ビリルビン）を測定し、差分から間接ビリルビンindirect bilirubin間接ビリルビン（indirect bilirubin）indirect bilirubin（間接ビリルビン）を求める。
基準値baseline / reference value基準値（baseline / reference value）baseline / reference value（基準値）：総ビリルビンtotal bilirubin総ビリルビン（total bilirubin）total bilirubin（総ビリルビン）<21 µmol/L、直接ビリルビンdirect bilirubin直接ビリルビン（direct bilirubin）direct bilirubin（直接ビリルビン）<5.5 µmol/L。肝性・溶血性・閉塞性黄疸obstructive jaundice閉塞性黄疸（obstructive jaundice）obstructive jaundice（閉塞性黄疸）で上昇分画のパターンが異なる。