Genetics · 4.7

常染色体劣性遺伝（AR II）

Autosomal recessive inheritance (AR II)

タグ: W8Practice / 実習
応用トピック: 嚢胞性線維症嚢胞性線維症

🧠 前半（CF・ヘモグロビン異常症Hemoglobinopathiesヘモグロビン異常症（Hemoglobinopathies）Hemoglobinopathies（ヘモグロビン異常症））は「同じ疾患カテゴリーの中でも変異の組み合わせが表現型の重症度を決める」ことを、後半（エピスタシスepistasisエピスタシス（epistasis）epistasis（エピスタシス）・RNA診断法）は「遺伝子間の相互作用」と「DNA診断を超えたRNAレベルの診断技術」を扱う——04-6-autosomal-recessive-inheritance-ar-iの続編として読む。締めくくりの症例ギャラリーfacultative case gallery症例ギャラリー（facultative case gallery）facultative case gallery（症例ギャラリー）は、WES・MLPAmultiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)MLPA（multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)）multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)（MLPA）・電気泳動判読という実技を多様な疾患に適用する総仕上げ。

症例：嚢胞性線維症

CFTR遺伝子（CF膜貫通コンダクタンスconductanceコンダクタンス（conductance）conductance（コンダクタンス）制御因子regulatory factor制御因子（regulatory factor）regulatory factor（制御因子））のイオンチャネル変異——04-1-monogenic-inheritanceで扱った基礎に加え、ここでは診断技術に焦点を当てる。CFTR遺伝子には約2,000種類の変異が同定されており（対立遺伝子異質性allelic heterogeneity対立遺伝子異質性（allelic heterogeneity）allelic heterogeneity（対立遺伝子異質性））、F508（508番目のフェニルアラニンphenylalanineフェニルアラニン（phenylalanine）phenylalanine（フェニルアラニン）をコードするトリプレットの欠失）が最頻変異。

診断アルゴリズム：

flowchart TD
  A["CF疑い患者"]
  A --> B["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='opposition'>対立</span>遺伝子特異的PCR（allele-specific PCR）でF508変異をスクリーニング<br><span class='jp-term jp-term-diagram' title='capillary gel electrophoresis'>キャピラリーゲル電気泳動</span>で判定"]
  B -->|"F508が検出される"| C["診断確定"]
  B -->|"典型的表現型だが頻用変異が検出されない"| D["NGSによる網羅的CFTR遺伝子解析へ進む"]

NGS解析の実際： 複数のオーバーラップするアンプリコンampliconアンプリコン（amplicon）amplicon（アンプリコン）でCFTR遺伝子全体をペアエンドpaired-endペアエンド（paired-end）paired-end（ペアエンド）でシーケンスし、リード深度（read depth／coverage）から変異アレルの割合を判定する——ヘテロ接合体heterozygoteヘテロ接合体（heterozygote）heterozygote（ヘテロ接合体）変異：リードの約50%に変異塩基、ホモ接合体homozygoteホモ接合体（homozygote）homozygote（ホモ接合体）変異：リードの約100%という判定基準が、CFTRだけでなくBRCA1などの他の遺伝子解析にも共通して適用される。

⚠️ NGSは「病的変異」と「ただの多様体」を区別しない——臨床的意義の判定には専用データベースが必要。 NGSはCFTR遺伝子のあらゆるバリアントを検出するが、病原性の有無は自動的にはわからない——CFTR2（https://cftr2.org/）のような臨床機能データベースを参照して初めて、検出された変異の臨床的意義を判定できる。

症例：ヘモグロビン異常症

鎌状赤血球症

症状： 貧血（脱力・頭痛・呼吸困難を伴う）、溶血（黄疸・腹痛・脾腫を伴う）。ヘテロ接合体優位性heterozygote advantageヘテロ接合体優位性（heterozygote advantage）heterozygote advantage（ヘテロ接合体優位性）が知られる（マラリア抵抗性、08-2-evolution-genetics参照）。

PCR-RFLP診断： ①DNA増幅、②制限酵素restriction endonuclease制限酵素（restriction endonuclease）restriction endonuclease（制限酵素）消化、③電気泳動、④エチジウムブロマイド染色、という4段階。ヘモグロビンS（HbS）の変異は特定の制限酵素restriction endonuclease制限酵素（restriction endonuclease）restriction endonuclease（制限酵素）認識部位を消失させる——正常アレル（A）は消化されて160bp＋80bpに、変異アレル（S）は切断されず未消化のまま残る、という長さの違いでジェノタイプを判定する。

サラセミア

症状： 溶血性貧血、黄疸、脾腫、骨格異常、輸血による鉄過剰。

アレル型	意味
β⁺アレル	β-グロビン合成の部分的低下
β⁰アレル	β-グロビン合成の完全欠損または著明な低下

表現型	遺伝子型
サラセミアThalassemiasサラセミア（Thalassemias）Thalassemias（サラセミア）軽症（マイナー、保因者）	β⁺またはβ⁰のヘテロ接合体heterozygoteヘテロ接合体（heterozygote）heterozygote（ヘテロ接合体）
サラセミアThalassemiasサラセミア（Thalassemias）Thalassemias（サラセミア）中間型intermediate type (intermediate-acting)中間型（intermediate type (intermediate-acting)）intermediate type (intermediate-acting)（中間型）（インターメディア）	β⁺／β⁺
サラセミア重症型thalassemia majorサラセミア重症型（thalassemia major）thalassemia major（サラセミア重症型）（メジャー）	β⁰／β⁺またはβ⁰／β⁰

⭐ サラセミアThalassemiasサラセミア（Thalassemias）Thalassemias（サラセミア）の出生前診断prenatal diagnosis出生前診断（prenatal diagnosis）prenatal diagnosis（出生前診断）は「2つの独立プローブによるクロスチェック」が原則——1回の検査だけでは信頼できない。サラセミアThalassemiasサラセミア（Thalassemias）Thalassemias（サラセミア）罹患児・保因児をもつ家系で母親が妊娠した場合、羊水穿刺amniocentesis羊水穿刺（amniocentesis）amniocentesis（羊水穿刺）後にサンガーシーケンシングで胎児の変異を確認する。サンガー法Sanger sequencingサンガー法（Sanger sequencing）Sanger sequencing（サンガー法）は点変異・小さな挿入欠失・重複・ヘテロ接合heterozygousヘテロ接合（heterozygous）heterozygous（ヘテロ接合）性・ミトコンドリアヘテロプラスミーheteroplasmyヘテロプラスミー（heteroplasmy）heteroplasmy（ヘテロプラスミー）まで検出可能で、ヘテロ接合体heterozygoteヘテロ接合体（heterozygote）heterozygote（ヘテロ接合体）はクロマトグラム上に2つの重なったピークとして、ホモ接合体homozygoteホモ接合体（homozygote）homozygote（ホモ接合体）は単一ピークとして現れる。

エピスタシス：劣性形質の発現を左右する遺伝子間相互作用

定義： 2つ以上の遺伝子が1つの表現型に寄与する場合、それらの遺伝子は「エピスタティック」と呼ばれる——ある遺伝子座のホモ接合劣性遺伝子型が、別の遺伝子座の発現そのものを覆い隠す（マスクする）現象。相互作用する遺伝子群が同一経路の異なる段階をコードするケースが典型的。

⭐ チロシナーゼtyrosinaseチロシナーゼ（tyrosinase）tyrosinase（チロシナーゼ）とPAHの変異が「毛色を決める遺伝子」を無意味にする——劣性エピスタシスepistasisエピスタシス（epistasis）epistasis（エピスタシス）の実例。チロシナーゼtyrosinaseチロシナーゼ（tyrosinase）tyrosinase（チロシナーゼ）遺伝子・フェニルアラニン水酸化酵素phenylalanine hydroxylase, PAHフェニルアラニン水酸化酵素（phenylalanine hydroxylase, PAH）phenylalanine hydroxylase, PAH（フェニルアラニン水酸化酵素）遺伝子のホモ接合劣性変異は、それぞれメラニン合成経路（フェニルアラニンphenylalanineフェニルアラニン（phenylalanine）phenylalanine（フェニルアラニン）→チロシン→L-ドーパ→ドーパキノンquinoneキノン（quinone）quinone（キノン）→メラニン）の上流をブロックする——毛色を決めるはずの下流遺伝子群の効果自体が発現しなくなる。「毛色遺伝子は正常でも、メラニン合成経路が根本から止まっていれば意味がない」というのが劣性エピスタシスepistasisエピスタシス（epistasis）epistasis（エピスタシス）の本質。

症例：ボンベイ式血液型

遺伝子型	表現型
HH または Hh	H抗原H antigenH抗原（H antigen）H antigen（H抗原）あり→フコース転移酵素が機能→A/B転移酵素でA・B抗原が付加可能
hh	H抗原H antigenH抗原（H antigen）H antigen（H抗原）そのものが作られない→A・B転移酵素があってもA・B抗原を付加できない→ボンベイ型（すべての血液型抗原blood group antigen血液型抗原（blood group antigen）blood group antigen（血液型抗原）が陰性）

FUT1遺伝子（フコース転移酵素）のホモ接合劣性変異により、ABO抗原O antigen (somatic antigen)O抗原（O antigen (somatic antigen)）O antigen (somatic antigen)（O抗原）合成の前駆体であるH抗原H antigenH抗原（H antigen）H antigen（H抗原）自体が作られない——ABO遺伝子型が正常であっても表現型上は「O型に見えるが実はO型でもない」特殊な型になる。頻度：インドで1万人に1人、ヨーロッパで100万人に1人。抗H・抗A・抗B抗体を産生するため、輸血はボンベイ型血液のみ可能。

⚠️ ABO血液型は「多重対立遺伝子性multiple allelism多重対立遺伝子性（multiple allelism）multiple allelism（多重対立遺伝子性）＋共優性codominant共優性（codominant）codominant（共優性）」の教材でもある。単一遺伝子に3つの対立opposition対立（opposition）opposition（対立）遺伝子（Iᴬ・Iᴮ・I⁰）があり、6つの遺伝子型が4つの表現型（O・A・B・AB）に対応する——IᴬとIᴮは共優性codominant共優性（codominant）codominant（共優性）、I⁰は両者に対し劣性。親子鑑定paternity test親子鑑定（paternity test）paternity test（親子鑑定）の演習： 母親（血液型A、IᴬI⁰）と夫（血液型AB、IᴬIᴮ）の間にO型（I⁰I⁰）の子が生まれた場合、夫は生物学的父ではありえない——I⁰アレルを夫はもたないため。

症例：眼の色のエピスタシス

ASIP・IRF4・SLC24A4・SLC24A5・SLC45A2・TPCN2・TYR・TYRP1という複数の遺伝子の効果が、OCA2・HERC2（01-1-introduction-to-human-geneticsの青い目の起源も参照）の発現調節と組み合わさり、連続的な眼の色のスペクトラムを生む——単一の「優性/劣性」では説明しきれない多遺伝子性polygenic多遺伝子性（polygenic）polygenic（多遺伝子性）エピスタシスepistasisエピスタシス（epistasis）epistasis（エピスタシス）の実例。

RNAベースの遺伝子診断法

💡 mRNAは不安定なので、まずcDNAに「変換」してから増幅する——これがRT-PCRの核心。 逆転写PCR（RT-PCR：reverse transcription PCR）はmRNA検出のための手法——mRNAは不安定なため、逆転写酵素でcDNA（相補DNA）に変換してからPCR増幅する。スプライシング変異・発現量の変化・組織特異性の検出に応用される。

リアルタイム／定量PCR

従来のPCRを「リアルタイムで追跡」できるよう発展させた手法——蛍光測定によりPCR産物の増幅過程を定量的に追跡できる。DNA定量・RNA定量（qRT-PCR、遺伝子発現・ウイルスRNA測定等）の両方に応用される。ハウスキーピング遺伝子housekeeping geneハウスキーピング遺伝子（housekeeping gene）housekeeping gene（ハウスキーピング遺伝子）（例：GAPDH）を内部標準として用い、検体間の比較を可能にする。

TaqManプローブの原理： プローブの片端に蛍光レポーター、もう片端にクエンチャーquencherクエンチャー（quencher）quencher（クエンチャー）（消光quenching消光（quenching）quenching（消光）団）を配置——両者が近接している間は蛍光が検出されない。プローブが標的配列に特異的にハイブリダイズした後、DNAポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性exonuclease activityエキソヌクレアーゼ活性（exonuclease activity）exonuclease activity（エキソヌクレアーゼ活性）がプローブを分解し、レポーターとクエンチャーquencherクエンチャー（quencher）quencher（クエンチャー）が離れることで蛍光が測定可能になる。閾値サイクルthreshold cycle, Ct閾値サイクル（threshold cycle, Ct）threshold cycle, Ct（閾値サイクル）＝増幅曲線が閾値ラインと交差する点——初期鋳型量の指標になる。

臨床応用clinical applications臨床応用（clinical applications）clinical applications（臨床応用）： マルチプレックスRT-PCRによるSARS-CoV-2検出（ORF1ab・N遺伝子・S遺伝子・MS2内部対照を同時に検出、S遺伝子欠失により変異株variant strain変異株（variant strain）variant strain（変異株）をアレル特異的RT-qPCRでスクリーニング可能）。

感染性病原体の検出

手法	原理	用途
通常PCR	特異的プライマーで標的DNAを増幅	サルモネラ菌等の細菌DNA検出
マルチプレックスPCR	複数の病原体を同時検出	消化管病原体パネル
ネステッドPCRnested PCRネステッドPCR（nested PCR）nested PCR（ネステッドPCR）（nested PCR）	外側プライマーで増幅後、内側プライマーで再増幅——非特異的産物を減らし特異度を高める	単純ヘルペスウイルスherpes simplex virus, HSV単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus, HSV）herpes simplex virus, HSV（単純ヘルペスウイルス）（HSV-1・HSV-2）の髄液・血液からの検出
RT-PCR	RNAウイルスの検出	エンテロウイルスenterovirusエンテロウイルス（enterovirus）enterovirus（エンテロウイルス）71型（手足口病hand-foot-mouth disease手足口病（hand-foot-mouth disease）hand-foot-mouth disease（手足口病）の原因）

総仕上げ：症例ギャラリー

セミナー末尾では、家系図pedigree家系図（pedigree）pedigree（家系図）・電気泳動写真・シーケンシング結果から遺伝子型を読み解く演習が多数の疾患にわたって行われる——いずれも「変異のタイプ（点変異・欠失・重複・モザイシズムmosaicismモザイシズム（mosaicism）mosaicism（モザイシズム））を、対応する分子診断molecular diagnostics分子診断（molecular diagnostics）molecular diagnostics（分子診断）技術（Sanger法・NGS・MLPAmultiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)MLPA（multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)）multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)（MLPA））の出力からどう読み取るか」という実技力を問う。

疾患	遺伝子・遺伝形式	診断技術・ポイント
遺伝性多発性外骨腫Exostosis外骨腫（Exostosis）Exostosis（外骨腫）症	EXT1、AD	家系図pedigree家系図（pedigree）pedigree（家系図）からの遺伝子型判定genotyping遺伝子型判定（genotyping）genotyping（遺伝子型判定）演習
家族性筋萎縮性側索硬化症amyotrophic lateral sclerosis, ALS筋萎縮性側索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）amyotrophic lateral sclerosis, ALS（筋萎縮性側索硬化症）	SOD1、AD	WESによる変異同定
重症家族性高コレステロール血症familial hypercholesterolemia, FH家族性高コレステロール血症（familial hypercholesterolemia, FH）familial hypercholesterolemia, FH（家族性高コレステロール血症）	LDLR等、AD	WESによる原因遺伝子causative gene原因遺伝子（causative gene）causative gene（原因遺伝子）同定、角膜輪corneal arcus角膜輪（corneal arcus）corneal arcus（角膜輪）・平面黄色腫xanthoma planum平面黄色腫（xanthoma planum）xanthoma planum（平面黄色腫）を伴う典型的FH表現型
脳室周囲結節性異所性灰白質periventricular nodular heterotopia脳室周囲結節性異所性灰白質（periventricular nodular heterotopia）periventricular nodular heterotopia（脳室周囲結節性異所性灰白質）	FLNA（Xq28）、XD	家系内の半接合体hemizygote半接合体（hemizygote）hemizygote（半接合体）・ヘテロ接合体heterozygoteヘテロ接合体（heterozygote）heterozygote（ヘテロ接合体）判定
非定型びまん性先天性高インスリン血症hyperinsulinemia高インスリン血症（hyperinsulinemia）hyperinsulinemia（高インスリン血症）	ABCC8	プロバンドprobandプロバンド（proband）proband（プロバンド）はモザイク変異（父はヘテロ接合heterozygousヘテロ接合（heterozygous）heterozygous（ヘテロ接合）保因者、母は正常ホモ接合）
Emery-Dreifuss様症候群	EMD、X連鎖	Sanger法：正常/半接合体hemizygote半接合体（hemizygote）hemizygote（半接合体）重複変異/ヘテロ接合体heterozygoteヘテロ接合体（heterozygote）heterozygote（ヘテロ接合体）（ピーク重複）の判別、洞性徐脈sinus bradycardia洞性徐脈（sinus bradycardia）sinus bradycardia（洞性徐脈）・洞停止sinus arrest洞停止（sinus arrest）sinus arrest（洞停止）を伴う心伝導障害cardiac conduction disturbance心伝導障害（cardiac conduction disturbance）cardiac conduction disturbance（心伝導障害）
フェニルケトン尿症phenylketonuria, PKUフェニルケトン尿症（phenylketonuria, PKU）phenylketonuria, PKU（フェニルケトン尿症）（欠失/重複検出）	PAH	MLPAmultiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)MLPA（multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)）multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)（MLPA）法（multiplex ligation-dependent probe amplification）でエクソン5・6の欠失、エクソン4の重複を検出

💡 MLPAmultiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)MLPA（multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)）multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)（MLPA）（マルチプレックス連結依存性プローブ増幅法）は「エクソン単位のコピー数copy numberコピー数（copy number）copy number（コピー数）」を調べる手法。通常のシーケンシングでは検出しにくいエクソン単位の欠失・重複を、複数のプローブを連結・増幅し電気泳動パターンの相対的なピーク高さから定量する——PKUのような疾患で、点変異では説明できない症例の原因を明らかにできる。

まとめ

CFTR遺伝子は約2,000種の変異をもつが最頻はF508で、対立opposition対立（opposition）opposition（対立）遺伝子特異的PCRでのスクリーニング→検出されない場合はNGSでの網羅的解析という段階的診断アルゴリズムをとる。NGSのバリアントコールは病原性データベース（CFTR2等）と照合して初めて臨床的意味をもつ。
鎌状赤血球症はPCR-RFLP（制限酵素restriction endonuclease制限酵素（restriction endonuclease）restriction endonuclease（制限酵素）認識部位の消失を利用）で、サラセミアThalassemiasサラセミア（Thalassemias）Thalassemias（サラセミア）はSanger法（クロマトグラムのピーク数でヘテロ/ホモ接合を判定）で診断され、出生前診断prenatal diagnosis出生前診断（prenatal diagnosis）prenatal diagnosis（出生前診断）では2つの独立プローブによる確認が原則。
エピスタシスepistasisエピスタシス（epistasis）epistasis（エピスタシス）は劣性ホモ接合遺伝子型が別遺伝子座の発現を覆い隠す現象で、チロシナーゼtyrosinaseチロシナーゼ（tyrosinase）tyrosinase（チロシナーゼ）×PAH（毛色）、FUT1×ABO遺伝子座（ボンベイ型血液型）が代表例。ABO血液型自体は多重対立遺伝子性multiple allelism多重対立遺伝子性（multiple allelism）multiple allelism（多重対立遺伝子性）＋共優性codominant共優性（codominant）codominant（共優性）の教材として親子鑑定paternity test親子鑑定（paternity test）paternity test（親子鑑定）にも応用される。
RT-PCR（mRNA→cDNA変換後に増幅）とリアルタイムPCRreal-time PCRリアルタイムPCR（real-time PCR）real-time PCR（リアルタイムPCR）（TaqManプローブによる蛍光定量、Ct値cycle threshold valueCt値（cycle threshold value）cycle threshold value（Ct値））はRNAレベルでの遺伝子診断を可能にし、SARS-CoV-2検出のような感染症診断にも応用される。ネステッドPCRnested PCRネステッドPCR（nested PCR）nested PCR（ネステッドPCR）は特異度を高める工夫。
症例ギャラリーfacultative case gallery症例ギャラリー（facultative case gallery）facultative case gallery（症例ギャラリー）はHME・ALS・重症FH・periventricular heterotopia・先天性高インスリン血症hyperinsulinemia高インスリン血症（hyperinsulinemia）hyperinsulinemia（高インスリン血症）・Emery-Dreifuss様症候群・PKU（MLPAmultiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)MLPA（multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)）multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)（MLPA））を横断し、Sanger法・NGS・MLPAmultiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)MLPA（multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)）multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)（MLPA）という診断技術の実践的判読力を養う。