微生物学で用いられる分子生物学的検査法

🧠 分子生物学的検査molecular methods 分子生物学的検査（molecular methods）molecular methods（分子生物学的検査） 法の強みは「病原体そのものではなく遺伝情報を検出する」ことに尽きる。 抗原検出や培養に頼らない分、感度・特異度が高く、培養困難な病原体や数週間かかる培養でも数時間〜数日で結果が出る。ただし1/8・1/9で学んだ「細菌がどう変異し、遺伝子をどう伝達するか」という生物学的機序とは主題が異なる——本トピックの主役は、その遺伝子を検査室でどう検出するかという技術である。

分子生物学的検査の利点

• 高い感度・特異度
• 抗原ではなく病原体そのもの（の遺伝情報）を検出する
• 高い輸送耐性——微量の検体でも検査可能
• 培養より迅速に結果が得られる

いつ分子生物学的検査を使うか

• 血清学的検査に適さない検体（便、水疱液など）
• 頻度の高い感染症（インフルエンザ、腸管ウイルス感染症）
• 交差反応cross-reactivity 交差反応（cross-reactivity）cross-reactivity（交差反応） を避けたい場合
• ウイルス株の同定、ウイルス変異、抗原シフトantigenic shift抗原シフト（antigenic shift）antigenic shift（抗原シフト）／ドリフトのエピジェネティック epigenetic エピジェネティック（epigenetic） epigenetic（エピジェネティック） 検査
• 治療モニタリング——ウイルスコピー数 copy number コピー数（copy number） copy number（コピー数） の測定（HIVHIV（human immunodeficiency virus）・HCVHCV（hepatitis C virus）・HBVHBV（hepatitis B virus））
• 薬剤耐性検査drug susceptibility testing 薬剤耐性検査（drug susceptibility testing）drug susceptibility testing（薬剤耐性検査） （HIV・HCV）
• 検体保存：4°Cで24時間、または−20°Cで24時間超（至適は−70°C）

PCR：DNAの増幅

• 菌種の同定に利用できる。
• Chlamydiaのように培養が困難な細菌の診断に利用できる。
• 耐性遺伝子の検出に利用できる。
• 毒素そのものではなく、毒素産生遺伝子の検出に利用できる。

⚠️ 多重PCRPCR（polymerase chain reaction）パネル（呼吸器・髄液・消化管など）は「検出＝原因」ではない。 同時に多数の病原体遺伝子を数時間で検出できる利便性の一方、無症候性の定着菌 colonizing flora 定着菌（colonizing flora） colonizing flora（定着菌） や既に排除された病原体の残存核酸まで拾い上げるため、陽性所見がそのまま臨床的な原因病原体を意味するとは限らない——臨床像と照合して解釈する必要がある。

💡 核酸を検出できることと、生きた病原体がいることは別問題である。 PCRは死菌由来の核酸や治療後に残存する断片も検出しうるため、治療効果判定（治癒判定）の道具 tool 道具（tool） tool（道具） としては使えない——培養や抗原検査など、生菌・活動性感染active infection 活動性感染（active infection）active infection（活動性感染） を反映する検査を代替できない。

• プライマーはウイルスゲノムの保存領域 conserved region 保存領域（conserved region） conserved region（保存領域） に設計され、全ての遺伝子型を検出できるようにする。
• DNADNA（deoxyribonucleic acid）ウイルス：ネステッドPCRnested PCR ネステッドPCR（nested PCR）nested PCR（ネステッドPCR） （nested PCR）——プライマーの非特異的結合 aspecific binding 非特異的結合（aspecific binding） aspecific binding（非特異的結合） を減らす目的で用いる。
• RNARNA（ribonucleic acid）ウイルス：逆転写PCR（reverse transcription PCR, RT-PCRRT-PCR（reverse transcription polymerase chain reaction））——RNAを鋳型にcDNAを合成してから増幅する。

flowchart TD
    A["鋳型となる2本鎖<span class='jp-term jp-term-diagram' title='deoxyribonucleic acid'>DNA</span>"] --> B["① 変性94〜96°C<br>2本鎖<span class='jp-term jp-term-diagram' title='deoxyribonucleic acid'>DNA</span>が1本鎖に解離する"]
    B --> C["② <span class='jp-term jp-term-diagram' title='annealing'>アニーリング</span>約68°C<br>プライマーが1本鎖<span class='jp-term jp-term-diagram' title='deoxyribonucleic acid'>DNA</span>に結合する"]
    C --> D["③ 伸長約72°C<br><span class='jp-term jp-term-diagram' title='deoxyribonucleic acid'>DNA</span>ポリメラーゼがプライマーから新生鎖を合成する"]
    D --> E["2本鎖<span class='jp-term jp-term-diagram' title='deoxyribonucleic acid'>DNA</span>が2倍に増幅される"]
    E -->|"サイクルを繰り返す"| B

定量PCR

• リアルタイムPCRreal-time PCR リアルタイムPCR（real-time PCR）real-time PCR（リアルタイムPCR） （real-time PCR, QPCR）とも呼ばれる。
• 治療モニタリングに用いる。
• 施設ごとにキャリブレーションが異なるため、異なる検査室間の結果は比較できない。
• 反応終了時点ではなく、反応の途中で標的DNAの増幅量を検出する点が通常のPCRとの違い。
• 検出は蛍光を利用する：
  • 二本鎖DNAdouble-stranded DNA 二本鎖DNA（double-stranded DNA）double-stranded DNA（二本鎖DNA） に非特異的に結合する蛍光色素 fluorescent dye蛍光色素（fluorescent dye） fluorescent dye（蛍光色素）
  • 相補配列とハイブリダイズした後にのみ検出可能となる、蛍光レポーターで標識された配列特異的DNAプローブ

サザンブロット・ノーザンブロット

• サザンブロットSouthern blotサザンブロット（Southern blot）Southern blot（サザンブロット）：DNA断片の検出。
• ノーザンブロットNorthern blotノーザンブロット（Northern blot）Northern blot（ノーザンブロット）：RNA断片の検出。

💡 MALDI-TOF MSMALDI-TOF MS（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry）は「分子」ではなく「蛋白質」を見る技術だが、菌種同定species-level identification 菌種同定（species-level identification）species-level identification（菌種同定） の主役を交代させた。 質量分析MALDI-TOF, matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry 質量分析（MALDI-TOF, matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry）MALDI-TOF, matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry（質量分析） はコロニーの蛋白質スペクトルをデータベースと照合して同定する手法で、核酸を検出するPCRとは原理が異なる。前向き研究では細菌分離株 isolate 分離株（isolate） isolate（分離株） 1,660株のうち95.4%が正しく同定され（84.1%が種レベル）、1株あたりの所要時間は平均6分・コストは従来法の22〜32%にとどまり、グラム染色・生化学的同定に取って代わりつつある¹。

💡 全ゲノムシークエンス sequence シークエンス（sequence） sequence（シークエンス） （WGS）は分子疫学 molecular epidemiology 分子疫学（molecular epidemiology） molecular epidemiology（分子疫学） の主役をパルスフィールドゲル電気泳動 pulsed-field gel electrophoresis, PFGE パルスフィールドゲル電気泳動（pulsed-field gel electrophoresis, PFGE） pulsed-field gel electrophoresis, PFGE（パルスフィールドゲル電気泳動） 法（PFGE）から奪いつつある。 1回の解析で菌種・血清型・病原因子virulence factor病原因子（virulence factor）virulence factor（病原因子）・薬剤耐性antimicrobial resistance, AMR 薬剤耐性（antimicrobial resistance, AMR）antimicrobial resistance, AMR（薬剤耐性） の情報をまとめて得られるため、従来の表現型に基づく型別を置き換えうる技術で、将来的には臨床検体から直接シークエンス sequence シークエンス（sequence） sequence（シークエンス） するメタゲノム解析 genome sequencing ゲノム解析（genome sequencing） genome sequencing（ゲノム解析） へと発展し、臨床診断・公衆衛生public health 公衆衛生（public health）public health（公衆衛生） サーベイランス surveillance サーベイランス（surveillance） surveillance（サーベイランス） をさらに変えうる²。

抗体検出：ELISA

酵素反応が基質を発色産物に変え、その色調変化から抗体量を算出する。

• 酵素標識enzyme label 酵素標識（enzyme label）enzyme label（酵素標識） 抗ヒト抗体を用いて対象抗体を検出する。
• 酵素-基質反応により発色させる。
• 洗浄ステップが結果の信頼性 reliability 信頼性（reliability） reliability（信頼性） を左右する重要な工程。
• 発色が濃いほど、対象抗体の量が多いことを示す。

まとめ

• 分子生物学的検査molecular methods 分子生物学的検査（molecular methods）molecular methods（分子生物学的検査） は病原体の遺伝情報を直接検出するため、感度・特異度が高く、培養困難な病原体や微量検体にも対応できるが、多重PCRパネルの陽性は定着菌 colonizing flora定着菌（colonizing flora） colonizing flora（定着菌）・残存核酸も拾うため臨床像との照合が必要で、治癒判定には使えない。
• PCRはDNAを指数関数的 exponentially 指数関数的（exponentially） exponentially（指数関数的） に増幅する手法で、変性→アニーリング annealing アニーリング（annealing） annealing（アニーリング） →伸長のサイクルを繰り返す。DNAウイルスにはネステッドPCR nested PCRネステッドPCR（nested PCR） nested PCR（ネステッドPCR）、RNAウイルスには逆転写PCR（RT-PCR）を用いる。
• 定量PCRquantitative PCR 定量PCR（quantitative PCR）quantitative PCR（定量PCR） （qPCR）は反応の途中で増幅量を蛍光検出 fluorescence detection 蛍光検出（fluorescence detection） fluorescence detection（蛍光検出） し、治療モニタリングに用いるが、施設間の結果比較はできない。
• サザンブロットSouthern blot サザンブロット（Southern blot）Southern blot（サザンブロット） はDNA、ノーザンブロットNorthern blot ノーザンブロット（Northern blot）Northern blot（ノーザンブロット） はRNAの検出に用いる。MALDI-TOFMALDI-TOF（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight）質量分析法 mass spectrometry 質量分析法（mass spectrometry） mass spectrometry（質量分析法） は蛋白質スペクトルによる同定でグラム染色・生化学的同定を置き換えつつあり、全ゲノムシークエンス sequence シークエンス（sequence） sequence（シークエンス） （WGS）はPFGEに代わる分子疫学 molecular epidemiology 分子疫学（molecular epidemiology） molecular epidemiology（分子疫学） の手法として、将来的にはメタゲノム解析 genome sequencing ゲノム解析（genome sequencing） genome sequencing（ゲノム解析） へと発展しうる。
• ELISAELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）は酵素-基質反応による発色を利用した抗体検出 antibody detection 抗体検出（antibody detection） antibody detection（抗体検出） 法で、洗浄ステップの精度が結果の信頼性 reliability 信頼性（reliability） reliability（信頼性） を左右する。
• 本トピックが扱う「検査室での遺伝子検出技術 Detection technology検出技術（Detection technology） Detection technology（検出技術）」は、1/8・1/9で学んだ「細菌における遺伝子の変異・伝達の生物学的機序」とは別の主題である点に注意。