Genetics · 7.2
ゲノミクスの手法
Methods in genomics
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🧠 この講義は「遺伝マーカーgenetic markers遺伝マーカー（genetic markers）genetic markers（遺伝マーカー）→連鎖・ハプロタイプhaplotypeハプロタイプ（haplotype）haplotype（ハプロタイプ）→仮説駆動型hypothesis-driven仮説駆動型（hypothesis-driven）hypothesis-driven（仮説駆動型）/仮説フリー型hypothesis-free仮説フリー型（hypothesis-free）hypothesis-free（仮説フリー型）研究→3世代のシーケンシング技術→動物モデルanimal models動物モデル（animal models）animal models（動物モデル）」という、複合疾患complex disease複合疾患（complex disease）complex disease（複合疾患）の遺伝的背景genetic background遺伝的背景（genetic background）genetic background（遺伝的背景）を探る実際のツールキットを俯瞰する構成で読む。 各技術には固有の強み・弱みがあり、「何を検出したいか」によって適切な世代のシーケンシング・適切な研究デザインstudy design研究デザイン（study design）study design（研究デザイン）を選び分ける判断力が問われる。
遺伝マーカー
遺伝マーカーgenetic markers遺伝マーカー（genetic markers）genetic markers（遺伝マーカー）＝染色体上の既知の位置をもち、相同染色体homologous chromosomes相同染色体（homologous chromosomes）homologous chromosomes（相同染色体）上の異なる対立opposition対立（opposition）opposition（対立）遺伝子を高い確率で識別できる配列バリアントsequence variant配列バリアント（sequence variant）sequence variant（配列バリアント）。
| 型 | 特徴 |
|---|---|
| マイクロサテライトmicrosatelliteマイクロサテライト（microsatellite）microsatellite（マイクロサテライト）／STR（短鎖タンデム反復short tandem repeats, STR短鎖タンデム反復（short tandem repeats, STR）short tandem repeats, STR（短鎖タンデム反復）） | 2〜6ヌクレオチド単位の反復（例：(TA)ₙ、(CGG)ₙ、(GATA)ₙ）。高度に多型性polymorphic多型性（polymorphic）polymorphic（多型性）に富み、主に個人識別personal identification個人識別（personal identification）personal identification（個人識別）（DNAフィンガープリンティング）に利用（04-5-autosomal-dominant-inheritance-ad-ii参照） |
| SNP（一塩基多型single-nucleotide polymorphisms, SNP一塩基多型（single-nucleotide polymorphisms, SNP）single-nucleotide polymorphisms, SNP（一塩基多型）） | 二値的Quantal / binary二値的（Quantal / binary）Quantal / binary（二値的）、STRより著しく多い（700種超）、検出が容易、集団遺伝学population genetics集団遺伝学（population genetics）population genetics（集団遺伝学）における疾患の遺伝的背景genetic background遺伝的背景（genetic background）genetic background（遺伝的背景）解明に利用（06-1-population-genetics参照） |
組換え頻度と遺伝的距離
F2世代（孫世代）： 相同組換えhomologous recombination相同組換え（homologous recombination）homologous recombination（相同組換え）の結果、祖父母4人分のゲノムが孫の染色体上でモザイク状に混在する（3人分の色が見えても4人目の祖父母分は検出されないこともある）。
2つの遺伝子座間の組換え頻度は、両者間の物理的距離に比例する： 1%の組換え確率＝1センチモルガン（cM）≈1メガ塩基（Mb）（遺伝的距離と物理的距離の対応関係）。
ハプロタイプと連鎖不平衡
ハプロタイプhaplotypeハプロタイプ（haplotype）haplotype（ハプロタイプ）： 隣接する複数の対立opposition対立（opposition）opposition（対立）遺伝子が異なる個体間で頻繁に同時に受け継がれる（それらの間で交差組換えがきわめて稀）場合、それらは同一ハプロタイプhaplotypeハプロタイプ（haplotype）haplotype（ハプロタイプ）上にあるという。祖先ハプロタイプhaplotypeハプロタイプ（haplotype）haplotype（ハプロタイプ）は、その後の減数分裂での交差により変化していく——鎌状赤血球症の原因変異は少なくとも7,300年前に生じたと推定され、その周辺の少数のマーカー（T・Cアレル等）だけが確実な指標として残っている。
⭐ 連鎖不平衡linkage disequilibrium, LD連鎖不平衡（linkage disequilibrium, LD）linkage disequilibrium, LD（連鎖不平衡）は「2つの遺伝子座が独立に遺伝していない」ことを示す指標。 染色体上で近接する2つの遺伝子座が独立に遺伝しない状態——集団内での分布が無作為ではない。標準化LD係数D′・相関係数r²で定量化され、いずれも0＝平衡（2つの対立opposition対立（opposition）opposition（対立）遺伝子が異なる染色体上にある等）、1＝完全なLD（2つの対立opposition対立（opposition）opposition（対立）遺伝子が常に隣接）を意味する（06-1-population-geneticsのGWAS解釈も参照）。
疾患の遺伝的背景を探る研究手法
| 分類 | 内容 |
|---|---|
| ウェットラボwet labウェットラボ（wet lab）wet lab（ウェットラボ）手法（“wet” laboratory methods） | 古典的手法、測定、実験 |
| インシリコ手法in silico methodsインシリコ手法（in silico methods）in silico methods（インシリコ手法） | データベース評価、バイオインフォマティクスソフトウェア——ウェブ上のデータの（再）解析、新規遺伝子の発見（例：APOA5、05-3-complex-inheritance-ii参照）、メタ解析Meta-analysisメタ解析（Meta-analysis）Meta-analysis（メタ解析）（複数の先行研究の統合解析pooled analysis統合解析（pooled analysis）pooled analysis（統合解析）） |
| アプローチ | 手法 |
|---|---|
| 仮説駆動型hypothesis-driven仮説駆動型（hypothesis-driven）hypothesis-driven（仮説駆動型）（多くは遺伝学的手法） | ジェノタイピングgenotypingジェノタイピング（genotyping）genotyping（ジェノタイピング）（GWAS等）、集団遺伝学population genetics集団遺伝学（population genetics）population genetics（集団遺伝学）（関連解析association studies関連解析（association studies）association studies（関連解析））、遺伝子発現解析（マイクロアレイmicroarrayマイクロアレイ（microarray）microarray（マイクロアレイ）・シーケンシング）、動物モデルanimal models動物モデル（animal models）animal models（動物モデル）・動物実験animal testing動物実験（animal testing）animal testing（動物実験）、細胞・組織培養 |
| 仮説フリー型hypothesis-free仮説フリー型（hypothesis-free）hypothesis-free（仮説フリー型）（多くはゲノミクスgenomicsゲノミクス（genomics）genomics（ゲノミクス）的手法） | 全ゲノム規模の網羅的探索 |
候補遺伝子関連解析candidate gene association候補遺伝子関連解析（candidate gene association）candidate gene association（候補遺伝子関連解析）（最も一般的な仮説駆動型hypothesis-driven仮説駆動型（hypothesis-driven）hypothesis-driven（仮説駆動型）手法）： 候補遺伝子candidate gene候補遺伝子（candidate gene）candidate gene（候補遺伝子）の選定基準は、①既知の代謝経路に関わるタンパクの遺伝子、②ゲノムスクリーニングにより選定された遺伝子——変異が疾患の発症・症状に影響するかを、集団遺伝学population genetics集団遺伝学（population genetics）population genetics（集団遺伝学）・動物実験animal testing動物実験（animal testing）animal testing（動物実験）で検証する（05-2-complex-inheritance-i参照）。
GWAS（仮説フリー型hypothesis-free仮説フリー型（hypothesis-free）hypothesis-free（仮説フリー型）の代表）： 10万個超の遺伝的バリアントを一度に検査する、複合疾患complex disease複合疾患（complex disease）complex disease（複合疾患）・形質の遺伝的背景genetic background遺伝的背景（genetic background）genetic background（遺伝的背景）を調べる最も一般的な手法（06-1-population-genetics参照）。
シーケンシング技術の3世代
第1世代：サンガー法
DNA断片のヌクレオチド配列を決定する。サンガー法Sanger sequencingサンガー法（Sanger sequencing）Sanger sequencing（サンガー法）（鎖終結法chain-termination method鎖終結法（chain-termination method）chain-termination method（鎖終結法））が広く普及——蛍光標識ジデオキシヌクレオチドfluorescently labeled dideoxynucleotide (ddNTP)蛍光標識ジデオキシヌクレオチド（fluorescently labeled dideoxynucleotide (ddNTP)）fluorescently labeled dideoxynucleotide (ddNTP)（蛍光標識ジデオキシヌクレオチド）とキャピラリー電気泳動による自動化により、1反応で1配列（約800塩基）を決定できる。1塩基差の断片も識別可能な高分解能high resolution, HR高分解能（high resolution, HR）high resolution, HR（高分解能）をもつ。
第2世代：次世代シーケンシング
数百万本の短い（100〜500bp）DNA断片を並列にシーケンシングする（合成による配列決定、sequencing by synthesis）——高精度。
| 応用 | 内容 |
|---|---|
| WES（exome sequencing） | 単一遺伝子疾患monogenic disease単一遺伝子疾患（monogenic disease）monogenic disease（単一遺伝子疾患）の遺伝的背景genetic background遺伝的背景（genetic background）genetic background（遺伝的背景）解明（04-6-autosomal-recessive-inheritance-ar-i参照） |
| WGS（whole genome sequencing） | 全ゲノム解析genome sequencingゲノム解析（genome sequencing）genome sequencing（ゲノム解析） |
| RNA-seq | 遺伝子発現＋配列バリアントsequence variant配列バリアント（sequence variant）sequence variant（配列バリアント）・選択的スプライシングalternative splicing選択的スプライシング（alternative splicing）alternative splicing（選択的スプライシング）の検出 |
| バイサルファイトシーケンシングbisulfite sequencingバイサルファイトシーケンシング（bisulfite sequencing）bisulfite sequencing（バイサルファイトシーケンシング） | メチル化パターンの検出（03-2-epigenetics参照） |
| 病原体検出 | ウイルス変異・薬剤耐性antimicrobial resistance, AMR薬剤耐性（antimicrobial resistance, AMR）antimicrobial resistance, AMR（薬剤耐性）の検出 |
| メタゲノミクスmetagenomicsメタゲノミクス（metagenomics）metagenomics（メタゲノミクス） | 100〜1,000種の細菌を同時にシーケンシング・検出（マイクロバイオームmicrobiomeマイクロバイオーム（microbiome）microbiome（マイクロバイオーム）解析） |
| ChIP-seq（chromatin immunoprecipitation sequencing） | DNA-タンパク質相互作用の検出（例：プロモーター上の転写因子結合） |
PheWAS vs GWAS：
| 手法 | 問い |
|---|---|
| GWAS（genome-wide association study） | どのDNAバリアントが1つの表現型に影響するか |
| PheWAS（phenome-wide association study） | 1つの遺伝的バリアントが多数の表現型とどう関連するか |
両者ともマンハッタンプロットManhattan plotマンハッタンプロット（Manhattan plot）Manhattan plot（マンハッタンプロット）で結果を可視化する（06-1-population-genetics参照）。
第3世代：ロングリードシーケンシング
2万〜100万塩基の長いDNA配列を決定する。ナノポアシーケンシングnanopore sequencingナノポアシーケンシング（nanopore sequencing）nanopore sequencing（ナノポアシーケンシング）：DNA鎖を膜上の微小孔（ナノポアnanoporeナノポア（nanopore）nanopore（ナノポア））に直接通し、電流変化から塩基配列を読む——かつて15%だった誤り率は現在99.7%の精度まで向上。PacBioシーケンシング：精度99.9%、約20kb。
⭐ 第3世代シーケンシングの最大の強みは「PCR増幅不要」と「反復配列repetitive sequence反復配列（repetitive sequence）repetitive sequence（反復配列）に強い」の2点。 PCR増幅が不要なため増幅困難な領域もシーケンシングでき、短い重複配列から組み立てる必要がある第1・2世代では読めなかった反復配列repetitive sequence反復配列（repetitive sequence）repetitive sequence（反復配列）を直接解読できる——セントロメアcentromereセントロメア（centromere）centromere（セントロメア）領域・端部動原体centromere / kinetochore動原体（centromere / kinetochore）centromere / kinetochore（動原体）染色体の短腕p arm短腕（p arm）p arm（短腕）は2021年まで解読不能だったが（T2Tコンソーシアム、07-1-introduction-to-genomics参照）、第3世代シーケンシングで解決した。ハプロタイプhaplotypeハプロタイプ（haplotype）haplotype（ハプロタイプ）の決定も第1・2世代では不可能（遺伝子型＝ヘテロ/ホモ接合の判定のみ）だが、1本のDNA鎖をそのままシーケンシングする第3世代では可能——HLAハプロタイプhaplotypeハプロタイプ（haplotype）haplotype（ハプロタイプ）と1型糖尿病リスクの関連解析association studies関連解析（association studies）association studies（関連解析）に応用される。
3世代の使い分け： 高コスト・相対的低精度・新鮮fresh新鮮（fresh）fresh（新鮮）検体限定という短所をもつが、①単一遺伝子の標的シーケンシングには第1世代（少量なら最良）、②大量・網羅的シーケンシングには第2世代、③反復配列repetitive sequence反復配列（repetitive sequence）repetitive sequence（反復配列）・ハプロタイプhaplotypeハプロタイプ（haplotype）haplotype（ハプロタイプ）・構造変異には第3世代、と将来的には3世代が並存すると考えられている。
エピジェネティクスの検出
エピジェネティックepigeneticエピジェネティック（epigenetic）epigenetic（エピジェネティック）調節異常： がん抑制遺伝子・ミューテーター遺伝子mutator geneミューテーター遺伝子（mutator gene）mutator gene（ミューテーター遺伝子）の高メチル化hypermethylation高メチル化（hypermethylation）hypermethylation（高メチル化）（例：大腸がんの40%でp16遺伝子がメチル化）、がん遺伝子の低メチル化hypomethylation低メチル化（hypomethylation）hypomethylation（低メチル化）（03-2-epigenetics参照）。全ゲノムバイサルファイトシーケンシングwhole-genome bisulfite sequencing (WGBS)全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（whole-genome bisulfite sequencing (WGBS)）whole-genome bisulfite sequencing (WGBS)（全ゲノムバイサルファイトシーケンシング）：バイサルファイト変換でシトシンをウラシルuracilウラシル（uracil）uracil（ウラシル）に変換する一方、5-メチルシトシンは変換されないまま残る——変換前後の配列を比較し、シトシンのまま残った部位がメチル化部位と判定される。
全ゲノム遺伝子発現解析： マイクロアレイmicroarrayマイクロアレイ（microarray）microarray（マイクロアレイ）（例：44kチップで44,000種のmRNA発現量を同時測定）。
動物モデル
| 利点 | 欠点 |
|---|---|
| 自由な交配が可能 | 類似疾患でも病態機序が異なりうる |
| マウスの世代時間generation time世代時間（generation time）generation time（世代時間）はわずか2か月 | ゲノムレベルでの相違が大きい（特にジャンク領域） |
| 厳密に管理された環境で飼育可能 | 相同遺伝子でも機能が異なりうる |
| 必須遺伝子essential gene必須遺伝子（essential gene）essential gene（必須遺伝子）はマウスと大部分共通（マウスとの違いはわずか300遺伝子、07-1-introduction-to-genomics参照） | — |
| 組織採取が容易 | — |
| 遺伝子改変動物GM animals遺伝子改変動物（GM animals）GM animals（遺伝子改変動物）の作製が可能 | — |
| 多様なヒト疾患モデルが存在 | — |
遺伝子改変動物GM animals遺伝子改変動物（GM animals）GM animals（遺伝子改変動物）： ノックアウトknock-outノックアウト（knock-out）knock-out（ノックアウト）マウス（遺伝子不活化による疾患モデル作製、遺伝子機能研究）、トランスジェニックマウス（疾患モデル、遺伝子機能研究）、生体内in vivo生体内（in vivo）in vivo（生体内）遺伝子改変（CRISPR/Cas9、12-1-gene-therapy参照）。
💡 ENU変異誘発は「まず変異を大量に作ってから、表現型で選別する」という逆方向のアプローチ。 ENU（エチルニトロソ尿素）は雄マウスに変異を誘導し、野生型雌と交配——G1世代を優性変異についてスクリーニングできるが、劣性変異の場合はG1雄由来のG3世代でホモ接合個体を回収する必要がある。
まとめ
- 遺伝マーカーgenetic markers遺伝マーカー（genetic markers）genetic markers（遺伝マーカー）はマイクロサテライトmicrosatelliteマイクロサテライト（microsatellite）microsatellite（マイクロサテライト）（STR、個人識別personal identification個人識別（personal identification）personal identification（個人識別）向け）とSNP（多数・集団遺伝学population genetics集団遺伝学（population genetics）population genetics（集団遺伝学）向け）に大別され、組換え頻度（1cM≈1Mb）とハプロタイプhaplotypeハプロタイプ（haplotype）haplotype（ハプロタイプ）・連鎖不平衡linkage disequilibrium, LD連鎖不平衡（linkage disequilibrium, LD）linkage disequilibrium, LD（連鎖不平衡）（LD）の概念が遺伝子マッピングの基盤になる。
- 疾患の遺伝的背景genetic background遺伝的背景（genetic background）genetic background（遺伝的背景）研究は仮説駆動型hypothesis-driven仮説駆動型（hypothesis-driven）hypothesis-driven（仮説駆動型）（候補遺伝子関連解析candidate gene association候補遺伝子関連解析（candidate gene association）candidate gene association（候補遺伝子関連解析））と仮説フリー型GWAS仮説フリー型（GWAS）GWAS（仮説フリー型）に大別され、ウェットラボwet labウェットラボ（wet lab）wet lab（ウェットラボ）手法とインシリコ手法in silico methodsインシリコ手法（in silico methods）in silico methods（インシリコ手法）（データベース解析・メタ解析Meta-analysisメタ解析（Meta-analysis）Meta-analysis（メタ解析））を組み合わせる。
- シーケンシングは第1世代（サンガー法Sanger sequencingサンガー法（Sanger sequencing）Sanger sequencing（サンガー法）、高精度・低スループット）→第2世代（NGS、WES/WGS/RNA-seq/メタゲノミクスmetagenomicsメタゲノミクス（metagenomics）metagenomics（メタゲノミクス）/ChIP-seq等、高スループット）→第3世代（ロングリード、PCR不要・反復配列repetitive sequence反復配列（repetitive sequence）repetitive sequence（反復配列）とハプロタイプhaplotypeハプロタイプ（haplotype）haplotype（ハプロタイプ）に強い）と進化し、それぞれ異なる用途に使い分けられる。PheWASはGWASの「逆方向」の問いを立てる手法。
- WGBSはメチル化検出の標準手法、マイクロアレイmicroarrayマイクロアレイ（microarray）microarray（マイクロアレイ）は網羅的遺伝子発現解析に用いられる。動物モデルanimal models動物モデル（animal models）animal models（動物モデル）はマウスを中心に多くの利点をもつが病態機序・ゲノムレベルの相違という限界があり、ノックアウトknock-outノックアウト（knock-out）knock-out（ノックアウト）/トランスジェニック技術・ENU変異誘発がその作製法。