遺伝子治療

🧠 遺伝子治療の3つのアプローチ——①遺伝子補充gene replacement遺伝子補充（gene replacement）gene replacement（遺伝子補充）、②標的遺伝子発現制御targeted gene expression標的遺伝子発現制御（targeted gene expression）targeted gene expression（標的遺伝子発現制御）、③ゲノム編集genome editingゲノム編集（genome editing）genome editing（ゲノム編集）——は、「変異のタイプに合わせて武器を選ぶ」という一貫した論理で読む。 機能喪失型変異loss-of-function mutation機能喪失型変異（loss-of-function mutation）loss-of-function mutation（機能喪失型変異）（劣性疾患）には遺伝子を「足す」、機能獲得型変異gain-of-function mutation機能獲得型変異（gain-of-function mutation）gain-of-function mutation（機能獲得型変異）（優性疾患）には遺伝子発現を「黙らせる」か変異そのものを「書き換える」——SMA・血友病・X-SCID・家族性高コレステロール血症familial hypercholesterolemia, FH家族性高コレステロール血症（familial hypercholesterolemia, FH）familial hypercholesterolemia, FH（家族性高コレステロール血症）という実例が、それぞれ異なる技術がなぜ選ばれたかを具体的に示す。

遺伝子治療とは

特定の遺伝子を操作することにより疾患を治療する介入——増強、置換、除去、修復を含み、治療的therapeutic治療的（therapeutic）therapeutic（治療的）・予防的目的で核酸を患者細胞に導入する。

アプローチ①：遺伝子補充療法

欠損遺伝子の機能を、正常遺伝子の導入により代替——機能喪失型変異loss-of-function mutation機能喪失型変異（loss-of-function mutation）loss-of-function mutation（機能喪失型変異）による疾患に適用される：①劣性疾患、②常染色体優性疾患（半数不全haploinsufficiency半数不全（haploinsufficiency）haploinsufficiency（半数不全）、04-1-monogenic-inheritance参照）。

ベクターの基本構造

遺伝子導入法

トランスフェクションtransfectionトランスフェクション（transfection）transfection（トランスフェクション）： 一部の細胞は裸のDNA（naked DNA）を自然に取り込む、マイクロインジェクションmicroinjectionマイクロインジェクション（microinjection）microinjection（マイクロインジェクション）、エレクトロポレーションelectroporationエレクトロポレーション（electroporation）electroporation（エレクトロポレーション）、ナノ粒子・遺伝子銃（DNAコートナノ粒子を「弾丸bullet弾丸（bullet）bullet（弾丸）」として用いる）。ウイルス： 受容体介在性エンドサイトーシスreceptor-mediated endocytosis受容体介在性エンドサイトーシス（receptor-mediated endocytosis）receptor-mediated endocytosis（受容体介在性エンドサイトーシス）により細胞内へ。リポソームliposomeリポソーム（liposome）liposome（リポソーム）・脂質ナノ粒子lipid nanoparticle (LNP)脂質ナノ粒子（lipid nanoparticle (LNP)）lipid nanoparticle (LNP)（脂質ナノ粒子）： 非ウイルスベクターNon-viral vectors非ウイルスベクター（Non-viral vectors）Non-viral vectors（非ウイルスベクター）として利用（01-1-introduction-to-human-geneticsのmRNAワクチンLNPも参照）。

生体内 vs Ex vivo戦略

ウイルスベクター

💡 「ウイルスは、外来遺伝情報を細胞に運び込むために高度に進化した天然のベクターである」（Kay et al., 2001）。 有害な遺伝子を除去して「牙を抜いた（crippled／gutless）」ウイルスベクターviral vectorsウイルスベクター（viral vectors）viral vectors（ウイルスベクター）を作製し、ヘルパーウイルスhelper virusヘルパーウイルス（helper virus）helper virus（ヘルパーウイルス）の助けを借りて細胞培養cell culture細胞培養（cell culture）cell culture（細胞培養）で大量増殖させる。遺伝子導入gene transfer遺伝子導入（gene transfer）gene transfer（遺伝子導入）後、ベクターは宿主ゲノムに組み込まれ永続的効果を生むか、染色体外要素（エピソームepisomeエピソーム（episome）episome（エピソーム））として残り一過性の効果にとどまるかのいずれかをたどる。

主要ウイルスベクターの比較

⚠️ ウイルスベクターviral vectorsウイルスベクター（viral vectors）viral vectors（ウイルスベクター）に共通する3つのリスク：組み込みによる変異、標的外細胞への感染、免疫応答の誘発。 ゲノムに組み込まれなければ効果は一過性にとどまる、組み込みが必須遺伝子essential gene必須遺伝子（essential gene）essential gene（必須遺伝子）に入れば変異を起こしうる（特にレトロretroレトロ（retro）retro（レトロ）ウイルス）、標的細胞target cell標的細胞（target cell）target cell（標的細胞）以外にも感染しうる、免疫応答を誘発しうる（特にアデノウイルスAdenovirusアデノウイルス（Adenovirus）Adenovirus（アデノウイルス））。

アデノウイルスベクター

二本鎖DNAゲノム、導入後はエピソームepisomeエピソーム（episome）episome（エピソーム）として存在（ゲノムに組み込まれない）、比較的高容量high volume (hypervolemic)高容量（high volume (hypervolemic)）high volume (hypervolemic)（高容量）（36〜38kb）——遺伝子治療試験で最も多用される。最初に承認されたAd製品：GENDICINE（p53を細胞に送達、頭頸部がんに適用）。

⚠️ Jesse Gelsingerの死は、アデノウイルスベクターadenoviral vectorアデノウイルスベクター（adenoviral vector）adenoviral vector（アデノウイルスベクター）の免疫原性immunogenicity免疫原性（immunogenicity）immunogenicity（免疫原性）という主要な欠点を世に知らしめた（04-2-role-of-sex-in-inheritanceも参照）。 オルニチントランスカルバミラーゼornithine transcarbamylase (OTC)オルニチントランスカルバミラーゼ（ornithine transcarbamylase (OTC)）ornithine transcarbamylase (OTC)（オルニチントランスカルバミラーゼ）欠損症（尿素回路異常urea cycle disorder尿素回路異常（urea cycle disorder）urea cycle disorder（尿素回路異常）、X連鎖優性、高アンモニア血症hyperammonemia高アンモニア血症（hyperammonemia）hyperammonemia（高アンモニア血症））の治療のためアデノウイルスベクターadenoviral vectorアデノウイルスベクター（adenoviral vector）adenoviral vector（アデノウイルスベクター）が投与された1999年の症例——サイトカインストームcytokine stormサイトカインストーム（cytokine storm）cytokine storm（サイトカインストーム）を来し、播種性血管内凝固症候群disseminated intravascular coagulation (DIC)播種性血管内凝固症候群（disseminated intravascular coagulation (DIC)）disseminated intravascular coagulation (DIC)（播種性血管内凝固症候群）で4日後に死亡。

アデノ随伴ウイルスベクター

単独では複製できない小型DNAウイルス、ヒトに疾患を起こさない、通常ゲノムに組み込まれない、分裂・非分裂細胞両方を標的にできる——現在知られる中で最も安全なウイルスベクターviral vectorsウイルスベクター（viral vectors）viral vectors（ウイルスベクター）（免疫原性immunogenicity免疫原性（immunogenicity）immunogenicity（免疫原性）が低い）。欠点：容量が小さい。

⭐ 血友病はAAVによる遺伝子治療の「理想的な標的」——肝臓への送達だけで完結する。 AAVを肝臓特異的プロモーターと組み合わせ、修飾F8・F9遺伝子（発現を強化）を肝臓へ送達する——免疫原性immunogenicity免疫原性（immunogenicity）immunogenicity（免疫原性）が低く、既存の抗体産生（既存免疫）さえも問題にならないケースが確認されている（04-8-sex-linked-inheritanceの血友病の項も参照）。

レトロウイルスベクター

ウイルスRNAが逆転写されcDNAとなりゲノムにランダムに組み込まれる——分裂細胞のみを標的にでき、比較的免疫原性immunogenicity免疫原性（immunogenicity）immunogenicity（免疫原性）が高いが非常に効率のよいベクターで、比較的大量のDNAを導入できる。

⚠️ X-SCIDのレトロretroレトロ（retro）retro（レトロ）ウイルス遺伝子治療は「成功と悲劇が同居する」教科書的症例。 IL-2受容体γ鎖gamma chainγ鎖（gamma chain）gamma chain（γ鎖）遺伝子変異によるX連鎖重症複合免疫不全症severe combined immunodeficiency重症複合免疫不全症（severe combined immunodeficiency）severe combined immunodeficiency（重症複合免疫不全症）に対するレトロretroレトロ（retro）retro（レトロ）ウイルス遺伝子治療は非常に有効で、10年後もT細胞・B細胞機能が検出可能、免疫グロブリン補充不要、ワクチン接種も可能となった——しかし治療を受けた患者のうち5人が白血病を発症した。原因として、①組み込み部位ががん遺伝子近傍だった、②導入細胞が異常量のIL-2Rγを発現し無制限の細胞増殖を起こした、という2つの機序が想定されている——レトロretroレトロ（retro）retro（レトロ）ウイルス遺伝子治療は危険たりうるという教訓。

対照的な成功例：アデノシンデアミナーゼadenosine deaminase (ADA)アデノシンデアミナーゼ（adenosine deaminase (ADA)）adenosine deaminase (ADA)（アデノシンデアミナーゼ）欠損症（常染色体劣性型autosomal recessive type常染色体劣性型（autosomal recessive type）autosomal recessive type（常染色体劣性型）SCID、dATP蓄積→T細胞破壊HLA-DR3/DR4細胞破壊（HLA-DR3/DR4）HLA-DR3/DR4（細胞破壊）→免疫不全）に対するex vivo遺伝子治療は、副作用なく（発がん性carcinogenicity発がん性（carcinogenicity）carcinogenicity（発がん性）の問題なく）極めて成功を収めている——標的細胞target cell標的細胞（target cell）target cell（標的細胞）・戦略の選択が結果を大きく左右する好例。

レンチウイルスベクター

HIVベースのベクター（導入遺伝子を運ぶウイルスは野生型HIVタンパクをもたず、表面も修飾されHIVに類似しない）——分裂細胞に限らず標的化でき、組み込み部位ががん遺伝子近傍を回避する（レトロretroレトロ（retro）retro（レトロ）ウイルスより安全）、より大きな導入遺伝子を組み込める。ADA-SCID治療にレンチウイルスベクターLentivirus vectorsレンチウイルスベクター（Lentivirus vectors）Lentivirus vectors（レンチウイルスベクター）を用いた成功例が報告されている。

アプローチ②：標的遺伝子発現制御

RNA・タンパクレベルでの過剰発現overexpression過剰発現（overexpression）overexpression（過剰発現）を抑制——標的疾患：優性疾患（優性阻害効果dominant negative effect優性阻害効果（dominant negative effect）dominant negative effect（優性阻害効果）・機能獲得型変異gain-of-function mutation機能獲得型変異（gain-of-function mutation）gain-of-function mutation（機能獲得型変異）、04-1-monogenic-inheritance参照）、がん、感染症。

RNA干渉とsiRNA/miRNA

flowchart TD
  A["shRNAプラスミドが細胞に導入され、shRNAへ転写される"]
  A --> B["Dicer酵素がshRNAを短い二本鎖siRNA（約21bp）に切断"]
  B --> C["siRNAがRISC複合体に結合し一本鎖化"]
  C --> D["一本鎖siRNAが標的特異的mRNAに結合"]
  D --> E["標的mRNAの分解、または<span class='jp-term jp-term-diagram' title='typical'>翻訳阻害</span><br>→ 遺伝子発現の抑制"]

症例：家族性高コレステロール血症とPCSK9標的siRNA

インクリシランinclisiranインクリシラン（inclisiran）inclisiran（インクリシラン）： PCSK9のmRNAを標的とするsiRNA——肝細胞のアシアロ糖タンパク受容体を介して取り込まれ、RISC複合体とともにPCSK9 mRNAを分解する。家族性高コレステロール血症familial hypercholesterolemia, FH家族性高コレステロール血症（familial hypercholesterolemia, FH）familial hypercholesterolemia, FH（家族性高コレステロール血症）の治療薬（04-1-monogenic-inheritanceのPCSK9の項も参照）。

アンチセンスオリゴヌクレオチド

標的RNAに相補的な一本鎖オリゴヌクレオチド（RNAまたはDNA）——mRNAレベルでタンパク合成protein synthesisタンパク合成（protein synthesis）protein synthesis（タンパク合成）を刺激・阻害する、成熟mRNAへの特定エクソンの取り込み・除外を助ける。

症例：SMAとヌシネルセン（アンチセンス療法の成功例）

脊髄性筋萎縮症spinal muscular atrophy脊髄性筋萎縮症（spinal muscular atrophy）spinal muscular atrophy（脊髄性筋萎縮症）（SMA）は小児期の最も頻度の高い遺伝性死因（8,000〜12,000出生に1人）、常染色体劣性autosomal recessive常染色体劣性（autosomal recessive）autosomal recessive（常染色体劣性）、保因者頻度carrier frequency保因者頻度（carrier frequency）carrier frequency（保因者頻度）は50人に1人、運動ニューロンの進行性死滅、SMN1遺伝子SMN1 geneSMN1遺伝子（SMN1 gene）SMN1 gene（SMN1遺伝子）変異が原因（04-1-monogenic-inheritanceも参照）。

健常者： SMN1が機能的SMNタンパクを産生。SMA患者： SMN1変異により機能的mRNA・タンパクが産生されない——SMN2（パラログparalogueパラログ（paralogue）paralogue（パラログ）、通常はエクソン7が選択的スプライシングalternative splicing選択的スプライシング（alternative splicing）alternative splicing（選択的スプライシング）でほぼ常に除外される「サイレント」遺伝子コピー）が唯一のバックアップとなる。

⭐ ヌシネルセンnusinersenヌシネルセン（nusinersen）nusinersen（ヌシネルセン）は「エクソン7を見捨てないでくれ」とSMN2に語りかけるアンチセンスantisenseアンチセンス（antisense）antisense（アンチセンス）薬。 ヌシネルセンnusinersenヌシネルセン（nusinersen）nusinersen（ヌシネルセン）はSMN2遺伝子のイントロン7に結合し、エクソン7を排除する異常スプライシングを阻害する——治療が有効なのはSMN2コピー数copy numberコピー数（copy number）copy number（コピー数）が2を超える場合——結果として機能的SMNタンパクが産生され正常表現型に近づく。SMN2ターゲティングにはヌシネルセンASOヌシネルセン（ASO）ASO（ヌシネルセン）に加え、リスジプラムrisdiplamリスジプラム（risdiplam）risdiplam（リスジプラム）（低分子）、ゾルゲンスマZolgensmaゾルゲンスマ（Zolgensma）Zolgensma（ゾルゲンスマ）（AAVによるSMN1遺伝子SMN1 geneSMN1遺伝子（SMN1 gene）SMN1 gene（SMN1遺伝子）導入）という3つのアプローチが存在する。

アプタマー

特定の低分子・タンパクに特異的に結合するRNA分子——抗体に類似した機能。ペガプタニブpegaptanibペガプタニブ（pegaptanib）pegaptanib（ペガプタニブ）： 最初に承認されたアプタマーAptamerアプタマー（Aptamer）Aptamer（アプタマー）、滲出型加齢黄斑変性age-related macular degeneration (AMD)加齢黄斑変性（age-related macular degeneration (AMD)）age-related macular degeneration (AMD)（加齢黄斑変性）（先進国での失明の最多原因）を標的——VEGF（血管新生を促進、新生血管angiogenesis新生血管（angiogenesis）angiogenesis（新生血管）からの漏出が浮腫・出血・視力障害を招く）を阻害する（他に抗体薬：ラニビズマブ・ベバシズマブbevacizumabベバシズマブ（bevacizumab）bevacizumab（ベバシズマブ））、硝子体内intravitreal硝子体内（intravitreal）intravitreal（硝子体内）投与。

アプローチ③：ゲノム編集

ヌクレアーゼによる部位特異的な一本鎖・二本鎖切断double-strand break二本鎖切断（double-strand break）double-strand break（二本鎖切断）を介し、DNAの挿入・欠失・置換をゲノム上で直接行う——切断は非相同末端結合NHEJ非相同末端結合（NHEJ）NHEJ（非相同末端結合）または相同組換えhomologous recombination相同組換え（homologous recombination）homologous recombination（相同組換え）（HDR）で修復される。標的疾患： 機能獲得gain of function機能獲得（gain of function）gain of function（機能獲得）型・優性阻害dominant-negative effect優性阻害（dominant-negative effect）dominant-negative effect（優性阻害）型変異による常染色体優性疾患、がん、感染症。

CRISPR/Cas9システムの構成要素

CRISPR＝Clustered Regularly-Interspaced Short Palindromic Repeats、Cas9＝CRISPR随伴系のエンドヌクレアーゼendonucleaseエンドヌクレアーゼ（endonuclease）endonuclease（エンドヌクレアーゼ）。

flowchart TD
  A["①ゲノムDNA配列（標的DNA）"]
  A --> B["②ガイドRNAが標的DNAと相同性に基づき結合"]
  B --> C["③Cas9酵素がガイドRNAに結合"]
  C --> D["④Cas9酵素が標的DNAの両鎖を切断"]
  D --> E["遺伝子不活化：NHEJによる修復<br>→ 挿入・欠失（indel）が生じる<br>分裂・非分裂細胞いずれでも可能"]
  D --> F["新規<span class='jp-term jp-term-diagram' title='gene transfer'>遺伝子導入</span>：HDRによる修復<br>→ 鋳型からゲノムへ新規DNAがコピーされる<br>分裂細胞のみ"]

CRISPR/Cas9の応用例

新しい遺伝子治療技術：塩基編集

シトシン塩基編集酵素cytosine base editor (CBE)シトシン塩基編集酵素（cytosine base editor (CBE)）cytosine base editor (CBE)（シトシン塩基編集酵素）： シチジンデアミナーゼcytidine deaminaseシチジンデアミナーゼ（cytidine deaminase）cytidine deaminase（シチジンデアミナーゼ）＋ウラシルuracilウラシル（uracil）uracil（ウラシル）グリコシラーゼglycosylaseグリコシラーゼ（glycosylase）glycosylase（グリコシラーゼ）阻害剤inhibitor阻害剤（inhibitor）inhibitor（阻害剤）。アデニン塩基編集酵素adenine base editor (ABE)アデニン塩基編集酵素（adenine base editor (ABE)）adenine base editor (ABE)（アデニン塩基編集酵素）： アデニンadenineアデニン（adenine）adenine（アデニン）デアミナーゼdeaminaseデアミナーゼ（deaminase）deaminase（デアミナーゼ）——単一遺伝子疾患monogenic disease単一遺伝子疾患（monogenic disease）monogenic disease（単一遺伝子疾患）を引き起こす変異の48%を修正できるとされる。

CRISPR/Cas9システムの利点： 精密な標的化と改変、複数のスペーサーspacerスペーサー（spacer）spacer（スペーサー）を同時使用し複数遺伝子を同時改変可能、抗生物質antibiotics抗生物質（antibiotics）antibiotics（抗生物質）耐性遺伝子等の望まない外来配列をゲノムに導入しない、使用が容易。

まとめ

• 遺伝子治療は遺伝子補充gene replacement遺伝子補充（gene replacement）gene replacement（遺伝子補充）（機能喪失型変異loss-of-function mutation機能喪失型変異（loss-of-function mutation）loss-of-function mutation（機能喪失型変異）向け）・標的遺伝子発現制御targeted gene expression標的遺伝子発現制御（targeted gene expression）targeted gene expression（標的遺伝子発現制御）（機能獲得gain of function機能獲得（gain of function）gain of function（機能獲得）型/優性阻害dominant-negative effect優性阻害（dominant-negative effect）dominant-negative effect（優性阻害）型変異向け）・ゲノム編集genome editingゲノム編集（genome editing）genome editing（ゲノム編集）（同上、より直接的）という3アプローチに分かれ、生体内in vivo生体内（in vivo）in vivo（生体内）（技術的に容易だが制御性が低い）とex vivo（複雑だが高度に制御可能）という2戦略で実施される。
• ウイルスベクターviral vectorsウイルスベクター（viral vectors）viral vectors（ウイルスベクター）はアデノウイルスAdenovirusアデノウイルス（Adenovirus）Adenovirus（アデノウイルス）（大容量・高免疫原性immunogenicity免疫原性（immunogenicity）immunogenicity（免疫原性）、Jesse Gelsinger症例）・AAV（最も安全、血友病治療の理想的ベクター）・レトロretroレトロ（retro）retro（レトロ）ウイルス（組み込み型、X-SCID治療での白血病合併症とADA-SCID治療の成功という対照例）・レンチウイルス（HIVベース、より安全な組み込み）に大別される。
• 標的遺伝子発現制御targeted gene expression標的遺伝子発現制御（targeted gene expression）targeted gene expression（標的遺伝子発現制御）はsiRNA/miRNA（RNAi機構、PCSK9標的inclisiranが実例）とアンチセンスオリゴヌクレオチドAntisense oligonucleotide, ASOアンチセンスオリゴヌクレオチド（Antisense oligonucleotide, ASO）Antisense oligonucleotide, ASO（アンチセンスオリゴヌクレオチド）（SMAのヌシネルセンnusinersenヌシネルセン（nusinersen）nusinersen（ヌシネルセン）が代表例、SMN2エクソン7スプライシング補正）、アプタマーAptamerアプタマー（Aptamer）Aptamer（アプタマー）（ペガプタニブpegaptanibペガプタニブ（pegaptanib）pegaptanib（ペガプタニブ）、VEGF阻害）を含む。ゾルゲンスマZolgensmaゾルゲンスマ（Zolgensma）Zolgensma（ゾルゲンスマ）（AAVによるSMN1導入）は遺伝子補充gene replacement遺伝子補充（gene replacement）gene replacement（遺伝子補充）とSMA治療の交点に位置する。
• ゲノム編集genome editingゲノム編集（genome editing）genome editing（ゲノム編集）はCRISPR/Cas9（ガイドRNA-Cas9複合体による部位特異的切断、NHEJ＝遺伝子不活化、HDR＝新規遺伝子導入gene transfer遺伝子導入（gene transfer）gene transfer（遺伝子導入））を中心に、CF・軟骨無形成症achondroplasia軟骨無形成症（achondroplasia）achondroplasia（軟骨無形成症）・HIV（CCR5編集）への応用が進み、塩基編集技術base editing (CBE/ABE)塩基編集技術（base editing (CBE/ABE)）base editing (CBE/ABE)（塩基編集技術）は単一遺伝子疾患monogenic disease単一遺伝子疾患（monogenic disease）monogenic disease（単一遺伝子疾患）変異の48%を修正できるとされる次世代技術。