配偶子形成

🧠 このセミナーは「不妊症infertility 不妊症（infertility）infertility（不妊症） の原因を突き止める」という臨床課題を軸に、配偶子形成gametogenesis 配偶子形成（gametogenesis）gametogenesis（配偶子形成） の細胞生物学（不分離non-disjunction 不分離（non-disjunction）non-disjunction（不分離） のリスク）→生殖補助医療 assisted reproductive technology (ART) 生殖補助医療（assisted reproductive technology (ART)） assisted reproductive technology (ART)（生殖補助医療） →着床前遺伝学的検査 preimplantation genetic testing (PGT) 着床前遺伝学的検査（preimplantation genetic testing (PGT)） preimplantation genetic testing (PGT)（着床前遺伝学的検査） という3段階のロジックで読む。 2つの実症例（D-二機能性タンパク欠損症 DBP deficiency二機能性タンパク欠損症（DBP deficiency） DBP deficiency（二機能性タンパク欠損症）、球状spherical 球状（spherical）spherical（球状） 精子症）はいずれも「不妊の原因を全ゲノム規模の検査で遡って突き止める」という同じ探偵仕事のパターンを示す。

配偶子形成のリスク

生殖細胞が接合体になるという配偶子形成 gametogenesis 配偶子形成（gametogenesis） gametogenesis（配偶子形成） の本質的リスクは、減数分裂性不分離meiotic non-disjunction減数分裂性不分離（meiotic non-disjunction）meiotic non-disjunction（減数分裂性不分離）——異数性ゲノム変異 aneuploid genome mutation 異数性ゲノム変異（aneuploid genome mutation） aneuploid genome mutation（異数性ゲノム変異） の原因（02-1-genetic-aspects-of-atypical-mitosis-and-meiosisも参照）。

⭐ 不分離non-disjunction 不分離（non-disjunction）non-disjunction（不分離） の親由来 parent-of-origin 親由来（parent-of-origin） parent-of-origin（親由来） と減数分裂段階は、染色体・核型ごとに異なる。 常染色体トリソミーの多くは母性 maternal 母性（maternal） maternal（母性） 由来で、母性maternal 母性（maternal）maternal（母性） 減数分裂Iのエラーが主要なクラスとなる（02-2-chromosomal-aberrationsの親由来 parent-of-origin 親由来（parent-of-origin） parent-of-origin（親由来） 別頻度表も参照）。一方、性染色体異数性sex chromosomal aneuploidy 性染色体異数性（sex chromosomal aneuploidy）sex chromosomal aneuploidy（性染色体異数性） では核型ごとに母性 maternal母性（maternal） maternal（母性）・父性paternal 父性（paternal）paternal（父性） 寄与が異なるため、「性染色体gonosome 性染色体（gonosome）gonosome（性染色体） は精子形成で高頻度」「常染色体と親由来 parent-of-origin 親由来（parent-of-origin） parent-of-origin（親由来） が逆転」と一律には扱わない。¹

受精のプロセス

減数分裂IIの完了→雄性染色体 gonosome 性染色体（gonosome） gonosome（性染色体） の脱凝縮→雌雄前核 pronuclei 雌雄前核（pronuclei） pronuclei（雌雄前核） の形成→前核の融合 pronuclear fusion 前核の融合（pronuclear fusion） pronuclear fusion（前核の融合） →接合体——受精卵 fertilized egg 受精卵（fertilized egg） fertilized egg（受精卵） は2つの極体 polar body 極体（polar body） polar body（極体） と2つの前核 two pronuclei 2つの前核（two pronuclei） two pronuclei（2つの前核） をもつ状態で観察される（Day 1、直径約0.1mm）。卵管を通じて輸送される。

症例1：不妊と診断オデッセイ——D-二機能性タンパク欠損症

35歳男性、小児期から進行する認知機能障害 cognitive impairment認知機能障害（cognitive impairment） cognitive impairment（認知機能障害）・感音難聴・歩行障害gait disturbance歩行障害（gait disturbance）gait disturbance（歩行障害）・不妊。近親婚consanguineous marriage 近親婚（consanguineous marriage）consanguineous marriage（近親婚） のない神経学的 neurological 神経学的（neurological） neurological（神経学的） に健常な両親の息子で、健常・妊孕性のある姉妹が1人。

不妊の疫学： 12か月後に妊娠しないカップルの割合を不妊と定義——1年以内の妊娠成功率85〜90%、カップルの約15%が不妊。

精査： 精液検査semen analysis 精液検査（semen analysis）semen analysis（精液検査） （spermiogram：肉眼的検査・顕微鏡検査microscopy 顕微鏡検査（microscopy）microscopy（顕微鏡検査） ＋白血球・細菌の有無）で無精子症azoospermia無精子症（azoospermia）azoospermia（無精子症）を確認。非閉塞性無精子症 azoospermia 無精子症（azoospermia） azoospermia（無精子症） の稀な遺伝的原因 genetic origin 遺伝的原因（genetic origin） genetic origin（遺伝的原因） は累積 cumulative 累積（cumulative） cumulative（累積） でも全体の5%未満——カルマン症候群 Kallmann syndrome カルマン症候群（Kallmann syndrome） Kallmann syndrome（カルマン症候群） （既知変異は少数）、クラインフェルター症候群Klinefelter syndromeクラインフェルター症候群（Klinefelter syndrome）Klinefelter syndrome（クラインフェルター症候群）、転座を伴う男性（偽半陰陽 hermaphroditism半陰陽（hermaphroditism） hermaphroditism（半陰陽）、SRY転座、04-2-role-of-sex-in-inheritance参照）、点変異/CNV（USP26・SOX3・TEX11・TEX14・MEIOB・DNAH6・DAZL・DAX-1・DMRT1等）。

内分泌検査： テストステロン低値（164 ng/dL、基準270〜1100）、FSHFSH（follicle-stimulating hormone）高値（15 mIU/mL、基準1〜8）、LHLH（luteinizing hormone）・ソマトメジンSomatomedinsソマトメジン（Somatomedins）Somatomedins（ソマトメジン）・プロラクチンは正常範囲。血中アミノ酸プロファイル異常（アラニンalanineアラニン（alanine）alanine（アラニン）・アスパラギンasparagineアスパラギン（asparagine）asparagine（アスパラギン）・グルタミン酸・イソロイシンisoleucine (Ile)イソロイシン（isoleucine (Ile)）isoleucine (Ile)（イソロイシン）・リジン・メチオニンmethionineメチオニン（methionine）methionine（メチオニン）・プロリンprolineプロリン（proline）proline（プロリン）・バリンvaline バリン（valine）valine（バリン） が軒並み基準値 baseline / reference value 基準値（baseline / reference value） baseline / reference value（基準値） 超）。

遺伝子検査genetic testing 遺伝子検査（genetic testing）genetic testing（遺伝子検査） の経過： ①ミトコンドリア・運動失調ataxia 運動失調（ataxia）ataxia（運動失調） 症関連18遺伝子のパネル検査（SCA1〜17・DRPLA・FRDA・AOA1/2・POLG・MELASMELAS（mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes (MELAS)）・MERRFMERRF（myoclonic epilepsy with ragged red fibers (MERRF)）・NARP）は陰性、②筋生検 muscle biopsy 筋生検（muscle biopsy） muscle biopsy（筋生検） の電子伝達系 electron transport chain 電子伝達系（electron transport chain） electron transport chain（電子伝達系） 検査は正常、③標的エクソーム exome エクソーム（exome） exome（エクソーム） シーケンシング（mtDNA＋核遺伝子1,598個のエクソン）で1,569個のSNV・InDelを検出——HSD17B4遺伝子（17β-ヒドロキシステロイド脱水素酵素IV、ペルオキシソームperoxisome ペルオキシソーム（peroxisome）peroxisome（ペルオキシソーム） 脂肪酸β酸化 fatty acid beta-oxidation 脂肪酸β酸化（fatty acid beta-oxidation） fatty acid beta-oxidation（脂肪酸β酸化） に関与）のエクソン10〜13の約12kb欠失＋ミスセンス missense (mutation) ミスセンス（missense (mutation)） missense (mutation)（ミスセンス） SNV（c.587C>T; p.A196V）を同定。²

⭐ プロバンドproband プロバンド（proband）proband（プロバンド） は複合ヘテロ接合体 compound heterozygote 複合ヘテロ接合体（compound heterozygote） compound heterozygote（複合ヘテロ接合体） ——2つの異なる変異（欠失＋ミスセンス missense (mutation)ミスセンス（missense (mutation)） missense (mutation)（ミスセンス））の組み合わせがこの疾患の正体だった。 サンガー法Sanger sequencing サンガー法（Sanger sequencing）Sanger sequencing（サンガー法） でミスセンス変異 missense mutation ミスセンス変異（missense mutation） missense mutation（ミスセンス変異） を、対立遺伝子特異的PCR（野生型386bp vs 欠失特異的785bp）で欠失を確認——診断：D-二機能性タンパク欠損症 DBP deficiency二機能性タンパク欠損症（DBP deficiency） DBP deficiency（二機能性タンパク欠損症）。典型例は乳児期から重篤だが、この報告は成人まで生存し無精子症 azoospermia 無精子症（azoospermia） azoospermia（無精子症） を呈したHSD17B4欠損例として、男性不妊male infertility 男性不妊（male infertility）male infertility（男性不妊） も表現型に含まれうることを示した。² HSD17B4の劣性変異 recessive variant 劣性変異（recessive variant） recessive variant（劣性変異） はペロー症候群Perrault syndrome ペロー症候群（Perrault syndrome）Perrault syndrome（ペロー症候群） （Perrault syndrome：卵巣形成異常＋感音難聴、末梢神経障害・運動失調ataxia 運動失調（ataxia）ataxia（運動失調） を伴うことがある）の原因にもなる——1つの遺伝子が複数の臨床像（対立遺伝子異質性allelic heterogeneity対立遺伝子異質性（allelic heterogeneity）allelic heterogeneity（対立遺伝子異質性）・表現度expressivity 表現度（expressivity）expressivity（表現度） の変動）を生む例（04-1-monogenic-inheritance参照）。

生殖補助医療

不妊治療に用いられる医療技術——3つの軸で分類される：①配偶子の由来（夫婦 or ドナー）、②受精の場（妻の体内、検査室、代理母）、③妊娠の担い手（妻、代理母）。

主な技術： 配偶子卵管内移植gamete intrafallopian transfer (GIFT)配偶子卵管内移植（gamete intrafallopian transfer (GIFT)）gamete intrafallopian transfer (GIFT)（配偶子卵管内移植）、体外受精in vitro fertilization (IVF)体外受精（in vitro fertilization (IVF)）in vitro fertilization (IVF)（体外受精）・胚移植IVF+ET胚移植（IVF+ET）IVF+ET（胚移植）、顕微授精intracytoplasmic sperm injection, ICSI顕微授精（intracytoplasmic sperm injection, ICSI）intracytoplasmic sperm injection, ICSI（顕微授精）。

適応： 男性不妊male infertility 男性不妊（male infertility）male infertility（男性不妊） （精子異常：無精子症 azoospermia無精子症（azoospermia） azoospermia（無精子症）・球状spherical 球状（spherical）spherical（球状） 精子症・精子DNA断片化sperm DNA fragmentation精子DNA断片化（sperm DNA fragmentation）sperm DNA fragmentation（精子DNA断片化））、着床前遺伝学的検査preimplantation genetic testing (PGT) 着床前遺伝学的検査（preimplantation genetic testing (PGT)）preimplantation genetic testing (PGT)（着床前遺伝学的検査） を要する場合、女性不妊＋健常精子（卵管結紮 ligation 結紮（ligation） ligation（結紮） 等：通常のIVF）。円形精子細胞round spermatid 円形精子細胞（round spermatid）round spermatid（円形精子細胞） も受精に利用可能な場合がある。

胚培養の基本要件： 培養液（20種のアミノ酸を含む）、低酸素濃度、低/無VOC環境、最長培養5日間——EmbryoScope（内蔵カメラ cameraカメラ（camera） camera（カメラ）・顕微鏡による胚発生 embryogenesis 胚発生（embryogenesis） embryogenesis（胚発生） モニタリング）は形態・形態動態morphokinetics 形態動態（morphokinetics）morphokinetics（形態動態） に基づく胚選択を支援する。胚は接合体から胚盤胞 blastocyst 胚盤胞（blastocyst） blastocyst（胚盤胞） （blastocyst、Day 5）まで発生し、通常Day3またはDay5で移植される。

着床前遺伝学的検査

胚が抱える遺伝的リスクには孤発性sporadic 孤発性（sporadic）sporadic（孤発性） （sporadic：無作為、加齢関連）と再発性（単一遺伝子疾患monogenic disease 単一遺伝子疾患（monogenic disease）monogenic disease（単一遺伝子疾患） の遺伝による）の2種がある。

PGT（2017年に導入された総称）＝卵子ovum卵子（ovum）ovum（卵子）・胚の遺伝的異常 genetic abnormality遺伝的異常（genetic abnormality） genetic abnormality（遺伝的異常）、またはHLAHLA（human leukocyte antigen）型を判定するすべてのDNADNA（deoxyribonucleic acid）検査。

生検組織の種類と比較

PGTの臨床適応 clinical uses 臨床適応（clinical uses） clinical uses（臨床適応） ： 単一遺伝子疾患monogenic disease 単一遺伝子疾患（monogenic disease）monogenic disease（単一遺伝子疾患） の家族歴、片親の均衡型転座 balanced translocation均衡型転座（balanced translocation） balanced translocation（均衡型転座）、高齢妊娠advanced maternal age 高齢妊娠（advanced maternal age）advanced maternal age（高齢妊娠） （異数性aneuploidy 異数性（aneuploidy）aneuploidy（異数性） リスク）、反復IVF不成功、習慣流産recurrent pregnancy loss習慣流産（recurrent pregnancy loss）recurrent pregnancy loss（習慣流産）、同胞のHLAマッチングを目的とした胚選択。

栄養外胚葉trophectoderm 栄養外胚葉（trophectoderm）trophectoderm（栄養外胚葉） 生検の結果が胚全体をどの程度代表するかは判定カテゴリーにより異なり、とくにモザイク判定は慎重に解釈する。³ また、PGT-MやPGT-SRの適応と、異数性aneuploidy 異数性（aneuploidy）aneuploidy（異数性） を調べるPGT-Aを区別し、PGT-AをすべてのIVF患者へルーチンに行う有用性は確立していない。⁴

PGT/PGS で用いられる分子遺伝学的手法

PGTでは、QF-PCR、FISH、MLPA（04-8-sex-linked-inheritance参照）、aCGH（array comparative genomic hybridization）、NGSなどを目的に応じて用いる。G分染による核型検査 karyotyping 核型検査（karyotyping） karyotyping（核型検査） は出生前・出生後の染色体診断の基盤だが、少数細胞を扱うPGTの直接的検査法とは区別する。

💡 aCGH（比較ゲノムハイブリダイゼーション hybridizationハイブリダイゼーション（hybridization） hybridization（ハイブリダイゼーション））は「2色の蛍光シグナルの相対強度」でコピー数 copy number コピー数（copy number） copy number（コピー数） を読む手法。 被検試料と対照試料をそれぞれ異なる蛍光色素 fluorescent dye 蛍光色素（fluorescent dye） fluorescent dye（蛍光色素） で標識し、アレイ上で競合的 competitive 競合的（competitive） competitive（競合的） にハイブリダイズさせる。シグナル比が均等なら正常、偏りがあればコピー数 copy number コピー数（copy number） copy number（コピー数） の増減を疑うが、判定閾値と分解能はプラット rat ラット（rat） rat（ラット） フォーム・プローブ密度・検体品質で異なる。G分染法G-banding G分染法（G-banding）G-banding（G分染法） より高分解能 high resolution, HR 高分解能（high resolution, HR） high resolution, HR（高分解能） で、FISHFISH（fluorescence in situ hybridization）と異なりあらかじめ選んだ単一領域に限定されない全ゲノム的な検査が可能。欠点：モザイクや検体混入が結果に影響しうる。臨床応用clinical applications 臨床応用（clinical applications）clinical applications（臨床応用） ： 疾患特化型アレイ（DMDアレイ等）、血液腫瘍・がんアレイ、出生前アレイ、着床前アレイ。

症例： ある症例では胎児で第11染色体q22.3-q23.3領域に8.97Mbの欠失がaCGHで検出された。

症例3：家族性球状精子症とSPATA16遺伝子

生殖医療reproductive medicine 生殖医療（reproductive medicine）reproductive medicine（生殖医療） センターを受診した家系——6人の兄弟（罹患3人・健常3人）と4人の姉妹。健常な3人の兄弟はそれぞれ7人・6人・5人の子をもうけたが、罹患した3人の兄弟は子をもたず、乏精子症oligozoospermia乏精子症（oligozoospermia）oligozoospermia（乏精子症）・精子無力症asthenozoospermia精子無力症（asthenozoospermia）asthenozoospermia（精子無力症）・奇形精子症teratozoospermia 奇形精子症（teratozoospermia）teratozoospermia（奇形精子症） を伴う完全球状 spherical 球状（spherical） spherical（球状） 精子症（円頭・先体acrosome 先体（acrosome）acrosome（先体） 欠損：roundheadedness and acrosomelessness）を呈した。

ICSIを実施したが受精率は不良で妊娠に至らなかった。 Y染色体微小欠失 microdeletion 微小欠失（microdeletion） microdeletion（微小欠失） （04-8-sex-linked-inheritanceのAZF領域も参照）は検出されず、核型は46,XYと正常。

⭐ 全ゲノムSNPアレイによるホモ接合性 homozygous ホモ接合性（homozygous） homozygous（ホモ接合性） マッピングが、劣性原因遺伝子 causative gene 原因遺伝子（causative gene） causative gene（原因遺伝子） の探索範囲を絞り込んだ。 6人の兄弟に広範なホモ接合領域が観察され、家系内の血縁関係が示唆された——SPATA16遺伝子（精子形成関連16）エクソン4のSNP（c.848G>A）が原因変異として同定され、制限酵素restriction endonuclease 制限酵素（restriction endonuclease）restriction endonuclease（制限酵素） 認識部位（NciI／HpaII）を破壊するミスセンス変異 missense mutation ミスセンス変異（missense mutation） missense mutation（ミスセンス変異） であることが確認された。なお球状 spherical 球状（spherical） spherical（球状） 精子症全体ではDPY19L2異常が50〜70%を占め、SPATA16は稀な既知原因の1つと位置づける。⁵ ホモ接合性homozygous ホモ接合性（homozygous）homozygous（ホモ接合性） マッピングが劣性疾患の原因探索に役立つ実例である（04-6-autosomal-recessive-inheritance-ar-iの相補性 complementation 相補性（complementation） complementation（相補性） の議論、06-1-population-geneticsの家族内ゲノム類似性の項も参照）。

まとめ

• 配偶子形成gametogenesis 配偶子形成（gametogenesis）gametogenesis（配偶子形成） の本質的リスクは減数分裂性不分離 meiotic non-disjunction 減数分裂性不分離（meiotic non-disjunction） meiotic non-disjunction（減数分裂性不分離） で、常染色体トリソミーは母性 maternal 母性（maternal） maternal（母性） 由来が多い一方、性染色体異数性sex chromosomal aneuploidy 性染色体異数性（sex chromosomal aneuploidy）sex chromosomal aneuploidy（性染色体異数性） の親由来 parent-of-origin 親由来（parent-of-origin） parent-of-origin（親由来） は核型ごとに評価する。
• 症例1は、標的エクソーム解析 exome sequencing エクソーム解析（exome sequencing） exome sequencing（エクソーム解析） でHSD17B4のエクソン10〜13欠失とミスセンス変異 missense mutation ミスセンス変異（missense mutation） missense mutation（ミスセンス変異） の複合ヘテロ接合 compound heterozygous 複合ヘテロ接合（compound heterozygous） compound heterozygous（複合ヘテロ接合） にたどり着き、成人男性不妊 male infertility 男性不妊（male infertility） male infertility（男性不妊） まで含む表現型の広がりを示す。
• PGTでは極体 polar body極体（polar body） polar body（極体）・割球blastomere割球（blastomere）blastomere（割球）・栄養外胚葉trophectoderm 栄養外胚葉（trophectoderm）trophectoderm（栄養外胚葉） 生検に異なる限界があり、とくにモザイク判定は慎重に解釈する。PGT-Aを全IVF患者へルーチンに行う価値は確立していない。
• aCGHの閾値・分解能は検査系に依存する。球状spherical 球状（spherical）spherical（球状） 精子症ではDPY19L2が主因で、症例3のSPATA16変異は稀な原因をホモ接合性 homozygous ホモ接合性（homozygous） homozygous（ホモ接合性） マッピングで同定した例である。