生化学

生化学 · 8/2

血清総ビリルビン・直接ビリルビンの測定

Determination of total and direct serum bilirubin — P II

前提：正常
ヘムの生合成と分解；鉄の恒常性
検査値
ビリルビン

🧠 ビリルビン測定は「Jendrassik-Gróf法：とビリルビンを反応させアゾビリルビンを作る」原理で読む。 抱合型（直接）ビリルビンはなしでも速やかに反応するので「直接」、（間接）ビリルビンはなどの存在下で反応させる必要がある——この試薬設計の違いが両分画を分別測定する鍵。

ビリルビン代謝の復習

赤血球の寿命は約120日（反応の全体像はヘムのと分解）。がヘムのを酸化しCOを放出しながらを生成、がをビリルビンに変換する。ビリルビンは単結合まわりの回転でを作り、Z,Z配置をとる——分子表面全体が疎水性になり、血中ではアルブミンに結合して運ばれる（/）。肝でが抱合すると水溶性の抱合型/になり、胆汁中へ能動輸送される。

💡 新生児のと。 出生後は肝の活性が不十分なことが多く、大量に産生されるビリルビンを抱合しきれない。遊離が増えると脳へ移行してを起こしうる。青色光で排泄されやすい光へ変換するが標準的治療となる。1

ビリルビンの分画と臨床的意義

では血中の「直接・」がともに上昇しうる（肝炎・肝硬変など）。溶血性貧血では主に「」が上昇する。性黄疸（・胆石など）では「」が上昇し、尿・便中が著しく減少しうる。

測定原理：Jendrassik-Gróf法

はなどの存在下でと反応してアゾビリルビンを形成する。分画はなしでも速やかに反応するため、この反応性から「」と呼ばれる。発色と測定波長は試薬条件に依存し、本実習キットでは578 nmのを用いる。2

試薬化学

は（4-アミノ）。強酸性（HCl存在下）でとともに用いると、はジアゾ化されて（p-ジアゾ。これが作動試薬の本体）に変わる。これがUDP-ビリルビン（）としてアゾビリルビンを形成し、強酸性下で青色を呈する。

flowchart TD
  SA["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='sulfanilic acid'>スルファニル酸</span><br>4-アミノ<span class='jp-term jp-term-diagram' title='Benzene'>ベンゼン</span><span class='jp-term jp-term-diagram' title='sulfonic acid'>スルホン酸</span>"] -->|"<span class='jp-term jp-term-diagram' title='sodium nitrite'>亜硝酸ナトリウム</span>・<span class='jp-term jp-term-diagram' title='hydrochloric acid (HCl)'>塩酸</span><br>ジアゾ化（<span class='jp-term jp-term-diagram' title='non-enzymatic'>非酵素的</span>）"| DSA["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='diazotized sulfanilic acid'>ジアゾ化スルファニル酸</span><br>作動試薬"]
  DSA -->|"アゾ<span class='jp-term jp-term-diagram' title='coupling'>カップリング</span>（<span class='jp-term jp-term-diagram' title='non-enzymatic'>非酵素的</span>）"| AZO["アゾビリルビン<br>578 nmで<span class='jp-term jp-term-diagram' title='absorbance'>吸光度</span>を測定"]
  CB["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='conjugated bilirubin'>抱合型ビリルビン</span><br><span class='jp-term jp-term-diagram' title='direct bilirubin'>直接ビリルビン</span>・水溶性"] -->|"アゾ<span class='jp-term jp-term-diagram' title='coupling'>カップリング</span>（<span class='jp-term jp-term-diagram' title='non-enzymatic'>非酵素的</span>）<br><span class='jp-term jp-term-diagram' title='accelerator'>促進剤</span>なしで速やかに進む"| AZO
  UCB["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='unconjugated bilirubin'>非抱合型ビリルビン</span><br><span class='jp-term jp-term-diagram' title='albumin binding'>アルブミン結合</span>・<span class='jp-term jp-term-diagram' title='intramolecular hydrogen bond'>分子内水素結合</span>"] -->|"<span class='jp-term jp-term-diagram' title='caffeine'>カフェイン</span>などの<span class='jp-term jp-term-diagram' title='accelerator'>促進剤</span>で<span class='jp-term jp-term-diagram' title='solubilization'>可溶化</span><br><span class='jp-term jp-term-diagram' title='non-enzymatic'>非酵素的</span>"| UCBF["反応できる状態の<span class='jp-term jp-term-diagram' title='unconjugated bilirubin'>非抱合型ビリルビン</span>"]
  UCBF -->|"アゾ<span class='jp-term jp-term-diagram' title='coupling'>カップリング</span>（<span class='jp-term jp-term-diagram' title='non-enzymatic'>非酵素的</span>）"| AZO

💡 は「」で水溶性にしてから反応させる。 をこの方法で定量するには、が起こる前に水溶性構造へ変換し、反応を妨げている構造を解く必要がある。では反応部位がでふさがれ、しかもアルブミンに結合しているためである。などのが水素結合をほどき、アルブミンから解離させてこの役割を果たす。

flowchart TD
  A["血清試料"]
  A --> B["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='total bilirubin'>総ビリルビン</span>測定（T-B試薬：<span class='jp-term jp-term-diagram' title='caffeine'>カフェイン</span>含む）"]
  B --> C["直接（抱合型）＋間接（<span class='jp-term jp-term-diagram' title='caffeine'>カフェイン</span>で<span class='jp-term jp-term-diagram' title='solubilization'>可溶化</span>された<span class='jp-term jp-term-diagram' title='unconjugated'>非抱合型</span>）両方が反応"]
  A --> D["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='direct bilirubin'>直接ビリルビン</span>測定（D-B試薬：<span class='jp-term jp-term-diagram' title='caffeine'>カフェイン</span>なし）"]
  D --> E["抱合型（直接）ビリルビンのみが反応"]
  C --> F["578 nmで<span class='jp-term jp-term-diagram' title='absorbance'>吸光度</span>測定 → <span class='jp-term jp-term-diagram' title='total bilirubin'>総ビリルビン</span>濃度"]
  E --> G["578 nmで<span class='jp-term jp-term-diagram' title='absorbance'>吸光度</span>測定 → <span class='jp-term jp-term-diagram' title='direct bilirubin'>直接ビリルビン</span>濃度"]
  F --> H["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='indirect bilirubin'>間接ビリルビン</span> = <span class='jp-term jp-term-diagram' title='total bilirubin'>総ビリルビン</span> − <span class='jp-term jp-term-diagram' title='direct bilirubin'>直接ビリルビン</span>"]
  G --> H

実験手順

総ビリルビン測定（T-B試薬）

試薬成分 濃度
10.0 mmol/L
0.3 mol/L
クエン酸 1.0 mol/L
0.5 mol/L
2.3 mmol/L
—

直接ビリルビン測定（D-B試薬）

試薬成分 濃度
30.0 mmol/L
0.3 mol/L
クエン酸 1.0 mol/L
0.5 mmol/L
—
（を含まない） —

いずれも、標準液・試料（各50 µL）に作動試薬（1.0 mL）を加え、37°Cで5分間インキュベート後、578 nmで1（蒸留水）に対するを測定する。

濃度計算

csample=AsampleAstandard×cstandardc_{sample} = \frac{A_{sample}}{A_{standard}} \times c_{standard}
標準液 標準濃度の目安
Standard-T（） 27 µmol/L
Standard-D（） 12 µmol/L

（正確な標準濃度は製造ロットにより異なり、実習開始時に確定される。）

基準範囲

は測定法・施設・に依存するため、以下は本実習で用いる目安である。

項目
<21 µmol/L
<5.5 µmol/L

まとめ

  • ビリルビンはZ,Z配置で疎水性、の（間接）として血中を運ばれ、肝でされ水溶性のになる。
  • Jendrassik-Gróf法はとのを原理とし、本実習キットでは578 nmで測定する。
  • 抱合型（直接）ビリルビンはなしでも反応するため「直接」と呼ばれる。は（）でして初めて反応する。
  • T-B試薬（含む）で、D-B試薬（なし）でを測定し、差分からを求める。
  • 本実習の：<21 µmol/L、<5.5 µmol/L。肝性・溶血性・で上昇分画のパターンが異なる。

出典

  1. 1.Sixty years of phototherapy for neonatal jaundice—from serendipitous observation to standardized treatment and rescue for millions（Journal of Perinatology・2020）新生児高ビリルビン血症に対する光線療法の作用機序と臨床的位置づけ閲覧 2026-08-20
  2. 2.Candidate reference method for determination of total bilirubin in serum: development and validation（Clinical Chemistry・1985）Jendrassik-Gróf原理に基づく総ビリルビン測定とアゾビリルビン発色の標準化閲覧 2026-08-20