フローサイトメトリーと血球計数器（検体・免疫表現型・CD34・血球計数の原理と落とし穴）

🧠 全体像：フローサイトメトリー flow cytometry フローサイトメトリー（flow cytometry） flow cytometry（フローサイトメトリー） は、細胞を1個ずつ流してレーザーを当て、散乱光scattered light 散乱光（scattered light）scattered light（散乱光） （大きさと内部の複雑さ）と蛍光（結合した抗体の標識）を同時に測る検査で、白血病の免疫表現型 Immunophenotype免疫表現型（Immunophenotype） Immunophenotype（免疫表現型）、CD34陽性細胞CD34-positive cells CD34陽性細胞（CD34-positive cells）CD34-positive cells（CD34陽性細胞） の数、細胞周期、アポトーシス、サイトカインなどを数十秒で数万個の細胞から読む。血球計数 counting 計数（counting） counting（計数） 器は同じ原理（インピーダンスimpedanceインピーダンス（impedance）impedance（インピーダンス）・散乱光scattered light散乱光（scattered light）scattered light（散乱光）・蛍光）を日常の血算に使った装置で、白血球・赤血球・血小板を数える。どちらも検体（抗凝固薬・保存時間・温度）と装置の限界で結果が狂うので、数字より先に検体と散布図・ヒストグラム・塗抹を見る。原理と臨床の詳細はフローサイトメトリーflow cytometry フローサイトメトリー（flow cytometry）flow cytometry（フローサイトメトリー） （方法III）、検査前の一般論は検査前段階を参照する。

フローサイトメトリーの原理

flowchart TD
    A["細胞<span class='jp-term jp-term-diagram' title='buoyancy'>浮遊</span>液"] --> B["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='sheath fluid'>シース液</span>で細胞を1列に整える（<span class='jp-term jp-term-diagram' title='hydrodynamic focusing'>流体力学的集束</span>・<span class='jp-term jp-term-diagram' title='laminar flow'>層流</span>）"]
    B --> C["石英のフローセルでレーザーを照射"]
    C --> D["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='forward scatter, FSC'>前方散乱光</span>：細胞の大きさ"]
    C --> E["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='side scatter, SSC'>側方散乱光</span>：顆粒・核など内部の複雑さ"]
    C --> F["蛍光：標識抗体・DNA色素など"]
    D --> G["細胞1個ごとのデータを2次元・多次元の図に展開"]
    E --> G
    F --> G
    G --> H["ゲートで細胞集団を囲み、割合と蛍光の強さを評価"]

装置は、分取もできる据え置き型から携帯型・卓上の小型機まである（授業資料）。測定の対象は、細胞表面の受容体（CD：分化抗原群）、細胞内の物質（DNA・蛋白・サイトカイン・酵素）、可溶性因子（ビーズに抗体を付けて血清中のサイトカインを測る）である。細胞の分取（ソーティングcell sortingソーティング（cell sorting）cell sorting（ソーティング））では、レーザーで読んだ細胞を含む液滴に電荷を付け、電圧板で3本の管へ振り分ける。

検体と前処理

前処理は、分離（Ficoll密度勾配遠心 density gradient centrifugation 密度勾配遠心（density gradient centrifugation） density gradient centrifugation（密度勾配遠心） で単核球を得る・磁気ビーズ・蛋白分解酵素proteolytic enzyme 蛋白分解酵素（proteolytic enzyme）proteolytic enzyme（蛋白分解酵素） による組織の消化・細断）、染色（光を避けて抗体を反応させる。アイソタイプisotype アイソタイプ（isotype）isotype（アイソタイプ） 対照で非特異的な結合を見る。細胞内の標的には膜透過処理 permeabilization透過処理（permeabilization） permeabilization（透過処理））、固定（ホルムアルデヒドformaldehydeホルムアルデヒド（formaldehyde）formaldehyde（ホルムアルデヒド））の順に行う。授業資料の図は、アイソタイプisotype アイソタイプ（isotype）isotype（アイソタイプ） 対照（陰性対照）のヒストグラムが陰性集団の位置を決めることを示す。

⚠️ 安全上の落とし穴：髄液は直ちに、体液・組織も決められた時間内に処理しないと、細胞が劣化して結果の信頼性 reliability 信頼性（reliability） reliability（信頼性） が下がる。授業資料が避けるとした操作（組織の生理食塩水 saline 生理食塩水（saline） saline（生理食塩水） への浸漬・固定）は検体を使えなくしうる。再採取の難しい髄液・生検組織biopsy specimen 生検組織（biopsy specimen）biopsy specimen（生検組織） ほど、採取前に検査室へ連絡する。保存可能時間は抗凝固薬ごとに異なるので、血算（EDTA）の管を流用しない。

臨床応用

授業資料は表面マーカーと細胞内染色の併用の例として、CD3陽性細胞からCD4とCD8を順にゲートし、細胞内のIFN-γ・IL-2と表面のCD27・CD28・CD45RAでサイトカインを出すT細胞の亜集団を段階的に細分する図を示す（ゲートを重ねて分ける）。

免疫表現型Immunophenotype免疫表現型（Immunophenotype）Immunophenotype（免疫表現型）では、CDを組み合わせて細胞の性質を読む（授業資料の表）。

⚠️ 授業資料との差（旧い用語と決定木）：表の「抑制誘導」「抑制性」は古い用語で、現在はナイーブ・記憶・エフェクターの分化段階で整理する。授業資料の急性白血病acute leukemia 急性白血病（acute leukemia）acute leukemia（急性白血病） の決定木（HLA-DR → CD13・33 → B系・T系マーカー → CD19 → CD10 → CD20 → μ鎖、TdT、T系の分岐で、B前駆細胞の成熟段階・混合型・急性骨髄性白血病acute myeloid leukemia, AML急性骨髄性白血病（acute myeloid leukemia, AML）acute myeloid leukemia, AML（急性骨髄性白血病）・未分化型undifferentiated type未分化型（undifferentiated type）undifferentiated type（未分化型）・T細胞性急性リンパ性白血病 acute lymphoblastic leukemia, ALL 急性リンパ性白血病（acute lymphoblastic leukemia, ALL） acute lymphoblastic leukemia, ALL（急性リンパ性白血病） を決める。図の出典はDuqueら）は、少数のマーカーを順に問う旧来の方式である。現在は、細胞集団を同定するバックボーンマーカーと特徴づけマーカーを組み合わせた検証済みの8色パネル（単管のスクリーニングと多管の分類）で、WHO分類に基づく疾患群 disease group 疾患群（disease group） disease group（疾患群） の参照データと照らして多次元的に判定する¹。決定木は系統の考え方を学ぶ図として読み、実際の診断は自施設の標準化されたパネルと病理・遺伝子検査genetic testing 遺伝子検査（genetic testing）genetic testing（遺伝子検査） で決める（急性白血病acute leukemia 急性白血病（acute leukemia）acute leukemia（急性白血病） は急性白血病acute leukemia急性白血病（acute leukemia）acute leukemia（急性白血病））。

CD34陽性細胞CD34-positive cells CD34陽性細胞（CD34-positive cells）CD34-positive cells（CD34陽性細胞） の数は、自家autologous 自家（autologous）autologous（自家） 末梢血幹細胞 peripheral blood stem cell, PBSC 末梢血幹細胞（peripheral blood stem cell, PBSC） peripheral blood stem cell, PBSC（末梢血幹細胞） 移植の採取時期と移植片 graft 移植片（graft） graft（移植片） の評価に使う（自家造血幹細胞移植autologous hematopoietic stem cell transplantation (ASCT)自家造血幹細胞移植（autologous hematopoietic stem cell transplantation (ASCT)）autologous hematopoietic stem cell transplantation (ASCT)（自家造血幹細胞移植））。多系統の生着 engraftment 生着（engraftment） engraftment（生着） を担う細胞を数えるが、測定法が標準化されていないと施設間で値が大きく異なっていたため、ISHAGEが4パラメータ parameter パラメータ（parameter） parameter（パラメータ） 法（簡便・迅速・高感度）を多施設で検証した²。授業資料の図は、前方散乱forward scattering 前方散乱（forward scattering）forward scattering（前方散乱） ×側方散乱、CD34×CD45、側方散乱×CD34、CD34×CD45の4つの散布図で、CD34陽性細胞CD34-positive cells CD34陽性細胞（CD34-positive cells）CD34-positive cells（CD34陽性細胞） を段階的に囲む様子を示す。

血球計数器の原理

ペルオキシダーゼperoxidase ペルオキシダーゼ（peroxidase）peroxidase（ペルオキシダーゼ） 染色の雲状 cloud-like 雲状（cloud-like） cloud-like（雲状） 図は、8つの領域（ノイズ・有核赤血球Nucleated red blood cells有核赤血球（Nucleated red blood cells）Nucleated red blood cells（有核赤血球）・凝集した血小板・リンパ球と好塩基球 basophil好塩基球（basophil） basophil（好塩基球）・大型の染色されない細胞・単球・好中球・好酸球）に分かれる。形態の警告 warnings警告（warnings） warnings（警告）（フラグ）は、異型リンパ球atypical lymphocyte異型リンパ球（atypical lymphocyte）atypical lymphocyte（異型リンパ球）・幼若顆粒球immature granulocyte幼若顆粒球（immature granulocyte）immature granulocyte（幼若顆粒球）・ミエロペルオキシダーゼmyeloperoxidase (MPO) ミエロペルオキシダーゼ（myeloperoxidase (MPO)）myeloperoxidase (MPO)（ミエロペルオキシダーゼ） 欠損・有核赤血球Nucleated red blood cells有核赤血球（Nucleated red blood cells）Nucleated red blood cells（有核赤血球）・血小板凝集platelet aggregation血小板凝集（platelet aggregation）platelet aggregation（血小板凝集）を示し、出たら塗抹標本 smear preparation 塗抹標本（smear preparation） smear preparation（塗抹標本） を見る。

• 赤血球：等容積の球に変えてから、低角度散乱（2〜3度）で容積、大角度散乱（5〜15度）でヘモグロビン濃度 hemoglobin concentrationヘモグロビン濃度（hemoglobin concentration） hemoglobin concentration（ヘモグロビン濃度）を測る。容積とヘモグロビン濃度 hemoglobin concentration ヘモグロビン濃度（hemoglobin concentration） hemoglobin concentration（ヘモグロビン濃度） の散布図とヒストグラムができる。
• 血小板：赤血球と同じ原理。散布図は血小板・巨大血小板giant platelet巨大血小板（giant platelet）giant platelet（巨大血小板）・赤血球・赤血球の断片・赤血球の影に分かれ、パラメータparameter パラメータ（parameter）parameter（パラメータ） はPLT・MPV・L-PLT。
• 網状赤血球：球にしたあと蛍光色素fluorescent dye 蛍光色素（fluorescent dye）fluorescent dye（蛍光色素） でRNAを検出。未熟網状赤血球分画は現在の造血の活発さ（腎不全・骨髄移植Bone-marrow transplantation 骨髄移植（Bone-marrow transplantation）Bone-marrow transplantation（骨髄移植） の動員・貧血）、網状赤血球ヘモグロビン量は機能的に使える鉄（鉄欠乏性貧血iron-deficiency anemia, IDA鉄欠乏性貧血（iron-deficiency anemia, IDA）iron-deficiency anemia, IDA（鉄欠乏性貧血）・鉄治療の反応・エリスロポエチン治療erythropoietin therapyエリスロポエチン治療（erythropoietin therapy）erythropoietin therapy（エリスロポエチン治療））を示す。

血算の項目と基準

授業資料の血算（ハンガリーの施設の基準）と計算式は次のとおり。

計算で出す値は、MCV＝ヘマトクリット hematocrit, Hctヘマトクリット（hematocrit, Hct） hematocrit, Hct（ヘマトクリット）／赤血球数red blood cell count赤血球数（red blood cell count）red blood cell count（赤血球数）、MCH＝ヘモグロビン／赤血球数red blood cell count赤血球数（red blood cell count）red blood cell count（赤血球数）、MCHC＝ヘモグロビン／ヘマトクリットhematocrit, Hctヘマトクリット（hematocrit, Hct）hematocrit, Hct（ヘマトクリット）である。ヘマトクリットhematocrit, Hct ヘマトクリット（hematocrit, Hct）hematocrit, Hct（ヘマトクリット） は計算値なので、赤血球数red blood cell count 赤血球数（red blood cell count）red blood cell count（赤血球数） か容積が誤ると誤る。直接測って確実なのは白血球・赤血球・ヘモグロビン・MCVで、分画・網状赤血球・低値の血小板は信頼性 reliability 信頼性（reliability） reliability（信頼性） が下がり、RDW・MPV・PDWは装置で異なり標準化されていない。白血球分画differential 白血球分画（differential）differential（白血球分画） （授業資料）は、リンパ球が新生児20〜70%・乳児25〜50%・成人20〜40%、好中球が15〜60%・25〜60%・40〜70%、桿状核球band cell 桿状核球（band cell）band cell（桿状核球） が1〜8%・3〜6%・1〜2%と年齢で大きく変わる。

⚠️ 授業資料との差（基準範囲reference range 基準範囲（reference range）reference range（基準範囲） の性別・施設差）：授業の「ヘモグロビン130〜160 g/L、赤血球4〜5.5 T/L、ヘマトクリットhematocrit, Hct ヘマトクリット（hematocrit, Hct）hematocrit, Hct（ヘマトクリット） 0.4〜0.52」は1つの範囲で男女を分けておらず、男性寄りの値である。日本の共用基準範囲 reference range 基準範囲（reference range） reference range（基準範囲） の作成では、性別の基準範囲 reference range 基準範囲（reference range） reference range（基準範囲） が40項目中12項目で必要とされ、女性では45歳を境に年齢別の範囲が5項目で必要だった³。基準範囲reference range 基準範囲（reference range）reference range（基準範囲） は方法・施設・年齢・性で異なるので、授業の数値は「授業資料の基準値 baseline / reference value基準値（baseline / reference value） baseline / reference value（基準値）」として読み、自施設の基準範囲 reference range 基準範囲（reference range） reference range（基準範囲） と判定を使う。

干渉とアーチファクト

血算の誤差は、EDTA・ヘパリン・クエン酸の選択、保存時間、病態そのもの、装置の限界から生じる。1つの値の異常は他の値の妥当性 validity 妥当性（validity） validity（妥当性） も疑う手がかりで、MCHCは偽の結果を見抜く有力な指標である⁴。

寒冷凝集素cold agglutinin寒冷凝集素（cold agglutinin）cold agglutinin（寒冷凝集素）は自己免疫・伝染性単核症・マイコプラズマ肺炎Mycoplasma pneumoniae infection (atypical pneumonia) マイコプラズマ肺炎（Mycoplasma pneumoniae infection (atypical pneumonia)）Mycoplasma pneumoniae infection (atypical pneumonia)（マイコプラズマ肺炎） で現れ、冷えた検体で変化する（寒冷凝集素症cold agglutinin disease寒冷凝集素症（cold agglutinin disease）cold agglutinin disease（寒冷凝集素症））。ヘモグロビンの誤りの原因は、著明な白血球増多 leukocytosis白血球増多（leukocytosis） leukocytosis（白血球増多）・高度の脂質血症・ヘパリン血・溶血抵抗性の赤血球・黄疸、MCVの誤りの原因は、著明な白血球増多 leukocytosis白血球増多（leukocytosis） leukocytosis（白血球増多）・巨大血小板giant platelet巨大血小板（giant platelet）giant platelet（巨大血小板）・凝集した赤血球・36 fL未満の赤血球断片 red cell fragment赤血球断片（red cell fragment） red cell fragment（赤血球断片）・硬い赤血球である。

血小板は特に偽の値が多い。EDTAに依存する血小板凝集 platelet aggregation血小板凝集（platelet aggregation） platelet aggregation（血小板凝集）は、通常隠れている血小板膜の糖蛋白IIb/IIIaのエピトープがEDTAの存在下で露出して自己抗体が結合することで起こり、ほかに白血球の周りに血小板が付く衛星現象satellite phenomenon衛星現象（satellite phenomenon）satellite phenomenon（衛星現象）も偽の低値になる。逆に、赤血球断片red cell fragment赤血球断片（red cell fragment）red cell fragment（赤血球断片）・有核細胞all nucleated cells 有核細胞（all nucleated cells）all nucleated cells（有核細胞） の細胞質断片・クリオグロブリンcryoglobulinクリオグロブリン（cryoglobulin）cryoglobulin（クリオグロブリン）・細菌・脂質は偽の増加になる。血小板のパラメータ parameter パラメータ（parameter） parameter（パラメータ） だけでは不十分で、白血球分画differential 白血球分画（differential）differential（白血球分画） の散布図が警告 warnings 警告（warnings） warnings（警告） の手がかりになり、警告warnings 警告（warnings）warnings（警告） の出方は装置とソフトウェアの版で違う⁵。授業資料では、凝集した血小板は血小板ヒストグラムの右側の増加と塗抹の末端に現れ、巨大血小板giant platelet 巨大血小板（giant platelet）giant platelet（巨大血小板） は装置が赤血球とみなすため赤血球数 red blood cell count 赤血球数（red blood cell count） red blood cell count（赤血球数） は変わらず、血小板ヒストグラムの右側と赤血球ヒストグラムの左側が持ち上がる。

flowchart TD
    A["血小板が40 G/L未満"] --> B["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='microclot'>微小凝血塊</span>の有無を確認"]
    B --> C["塗抹で断片・<span class='jp-term jp-term-diagram' title='giant platelet'>巨大血小板</span>・小さな赤血球を確認"]
    C --> D{"凝集・<span class='jp-term jp-term-diagram' title='satellite phenomenon'>衛星現象</span>か"}
    D -->|"はい"| E["クエン酸血で再測定し偽の低値を除く<br>（<span class='jp-term jp-term-diagram' title='platelet transfusion'>血小板輸血</span>・<span class='jp-term jp-term-diagram' title='invasive procedure'>侵襲的処置</span>を決める前に）"]
    D -->|"いいえ"| F["真の血小板減少として原因を検索"]

検体の扱い（授業資料）は、K2-EDTA管を十分量採り、手作業では約0.5 mL、8時間以内に測定、塗抹は4時間以内、ヘパリンは背景が出るので不適、クエン酸は希釈されるので不適である。室温で8時間置くと、赤血球は両凹の形を失い、MCV↑・ヘマトクリットhematocrit, Hct ヘマトクリット（hematocrit, Hct）hematocrit, Hct（ヘマトクリット） ↑・白血球↓・リンパ球絶対数↓・MPV↑・IRF↓となり、網状赤血球は6時間後から減り、有核赤血球Nucleated red blood cells 有核赤血球（Nucleated red blood cells）Nucleated red blood cells（有核赤血球） は24〜36時間で消える。増えすぎた値は希釈して測る（授業資料）：白血球が著明に多いときは生理食塩水 saline 生理食塩水（saline） saline（生理食塩水） で1：2に希釈して結果を3倍し（ヘモグロビン・MCH・MCHCは使わない。血小板数platelet count 血小板数（platelet count）platelet count（血小板数） は白血球に影響されない）、赤血球が7.0 T/L超なら希釈する。

• 関連ノート：止血異常の検査、腫瘍マーカーtumor markers腫瘍マーカー（tumor markers）tumor markers（腫瘍マーカー）、免疫不全と自己免疫疾患の検査診断を参照する。

まとめ

• フローサイトメトリーflow cytometry フローサイトメトリー（flow cytometry）flow cytometry（フローサイトメトリー） は、散乱光scattered light 散乱光（scattered light）scattered light（散乱光） （大きさ・内部の複雑さ）と蛍光を細胞1個ずつ測る検査で、免疫表現型Immunophenotype免疫表現型（Immunophenotype）Immunophenotype（免疫表現型）・CD34・細胞周期・アポトーシス・サイトカイン・分取に使う。検体の種類ごとに保存温度と時間が決まり、髄液は直ちに搬送する。
• 授業の急性白血病 acute leukemia 急性白血病（acute leukemia） acute leukemia（急性白血病） の決定木と「抑制誘導」などの用語は旧い。現在は検証済みの多色パネルで多次元的に判定し、CD34は標準化されたISHAGE法で数える。
• 血球計数 counting 計数（counting） counting（計数） 器は電気抵抗・高周波high frequency高周波（high frequency）high frequency（高周波）・光学（ペルオキシダーゼperoxidase ペルオキシダーゼ（peroxidase）peroxidase（ペルオキシダーゼ） 染色）で白血球を3〜5分類し、赤血球は球にして容積とヘモグロビン濃度 hemoglobin concentrationヘモグロビン濃度（hemoglobin concentration） hemoglobin concentration（ヘモグロビン濃度）、網状赤血球は蛍光で測る。基準範囲reference range 基準範囲（reference range）reference range（基準範囲） は性・年齢・施設で異なる。
• 偽の値（EDTA依存性の血小板凝集 platelet aggregation血小板凝集（platelet aggregation） platelet aggregation（血小板凝集）、寒冷凝集素cold agglutinin寒冷凝集素（cold agglutinin）cold agglutinin（寒冷凝集素）、巨大血小板giant platelet巨大血小板（giant platelet）giant platelet（巨大血小板）、有核赤血球Nucleated red blood cells有核赤血球（Nucleated red blood cells）Nucleated red blood cells（有核赤血球）、脂質血症、白血球増多leukocytosis白血球増多（leukocytosis）leukocytosis（白血球増多））は、警告warnings警告（warnings）warnings（警告）・ヒストグラム・塗抹・MCHCで見抜き、他のパラメータ parameter パラメータ（parameter） parameter（パラメータ） の妥当性 validity 妥当性（validity） validity（妥当性） も疑う。血小板減少は輸血や処置の前にクエン酸血で再測定する。