遺伝学的検査の方法（PCR・シークエンシング・次世代シークエンサーと、褐色細胞腫・傍神経節腫の実例）

🧠 全体像：遺伝学的検査は、①どの方法で何が見えて何が見えないかと、②見つけたバリアントをどう分類・確認・報告・説明するかの2段で考える。授業は褐色細胞腫 pheochromocytoma褐色細胞腫（pheochromocytoma） pheochromocytoma（褐色細胞腫）・傍神経節腫paraganglioma 傍神経節腫（paraganglioma）paraganglioma（傍神経節腫） を主例に、PCR → スクリーニング法 → サンガー法Sanger sequencingサンガー法（Sanger sequencing）Sanger sequencing（サンガー法） → 次世代シークエンサー（NGS）→ エクソームexome エクソーム（exome）exome（エクソーム） と、検査が置き換わってきた道筋を辿る。授業の古い用語（変異と多型の頻度による定義）とスクリーニング法（SSCPなど）は現在使われず、報告は5段階の分類と確認の質で決まる。原理はPCRとゲノミクスgenomics ゲノミクス（genomics）genomics（ゲノミクス） の手法が正本で、本ノートは検体・適応・解釈・限界に絞る。

検査の種類・適応・限界

授業は論文の表を再掲し、検査の種類ごとの違いを示す¹。

単一遺伝子疾患monogenic disease単一遺伝子疾患（monogenic disease）monogenic disease（単一遺伝子疾患）は遺伝形式が既知で原因は1遺伝子の稀なバリアント、複雑疾患は複数の遺伝子や多型（SNP）が関わり、SNPマイクロアレイ microarrayマイクロアレイ（microarray） microarray（マイクロアレイ）・エクソームexomeエクソーム（exome）exome（エクソーム）・ゲノムで調べるが、リスクアレルの臨床的有用性は不明である。診断には、臨床遺伝医による臨床診断と家系図 pedigree家系図（pedigree） pedigree（家系図）、分子検査室による病的バリアント pathogenic variant 病的バリアント（pathogenic variant） pathogenic variant（病的バリアント） の検出、陽性例の遺伝カウンセリングと家族の検査のチームが要る。結果に基づく対応は、早期発見のスクリーニングと予防的介入、変異陽性家系の長期の追跡である。

法規の例として授業は、米国の遺伝情報差別禁止法（2008年。医療保険者が遺伝的素因 genetic predisposition 遺伝的素因（genetic predisposition） genetic predisposition（遺伝的素因） のある健康な人の加入を拒否したり保険料を上げたり、雇用者が遺伝情報を採用・解雇・昇進に使ったりすることを禁じる）と、ハンガリーの2008年第21号法（遺伝データの保護、検査と研究、バイオバンクbiobankバイオバンク（biobank）biobank（バイオバンク））を挙げる。ハンガリーの規定は、外部精度管理が利用できる検査は年4回以上、できない場合は年2回以上参加して適合し、遅くとも2013年1月からNAT認定を受けることである。米国の法律は生命保険などを対象としない（標準的な知識）。

⚠️ 授業資料との差（用語）：授業は変異・多型・バリアントを集団内の頻度（変異は1%未満（0.1%）、多型は6%超、バリアントは1〜6%）で定義し、変異は大きさ（点変異・染色体変異）、構造（置換・欠失・挿入・再配列）、由来（自然・誘発）で分類する。しかしACMGとAMPは「病的」「病的の疑い」「意義不明」「良性の疑い」「良性」の5段階で分類し、集団・計算・機能・分離の証拠を重み付けする²。頻度が高くても病的なものがあり、低くても無害なものが多い（点変異の種類）。授業の点変異の説明は、同義（多くは無影響で多型の大半）、ナンセンスnonsense (mutation) ナンセンス（nonsense (mutation)）nonsense (mutation)（ナンセンス） （停止コドンで短縮し機能喪失）、ミスセンスmissense (mutation) ミスセンス（missense (mutation)）missense (mutation)（ミスセンス） （アミノ酸が変わる。例はRETのCys634ArgによるMEN2）で、病気の原因の大半は点変異である。

方法の使い分け

flowchart TD
    A["検体：末梢血からDNAを抽出"] --> B["PCRで目的領域を増幅"]
    B --> C{"調べたいのは"}
    C -->|"既知の変異"| D["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='allele-specific PCR'>アレル特異的PCR</span>・<span class='jp-term jp-term-diagram' title='restriction endonuclease'>制限酵素</span>・TaqMan"]
    C -->|"未知の変異"| E["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='sequence'>シークエンス</span>（<span class='jp-term jp-term-diagram' title='Sanger sequencing'>サンガー法</span>・NGSパネル）"]
    C -->|"大きな欠失・重複"| F["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='real-time PCR'>リアルタイムPCR</span>・MLPA"]
    D --> G["バリアントを分類"]
    E --> G
    F --> G
    G --> H["必要なら<span class='jp-term jp-term-diagram' title='confirmatory test'>確認検査</span> → 報告・<span class='jp-term jp-term-diagram' title='counseling'>カウンセリング</span>"]

染色体の数・構造やコピー数 copy number コピー数（copy number） copy number（コピー数） はマイクロアレイmicroarrayマイクロアレイ（microarray）microarray（マイクロアレイ）・核型、出生前は出生前遺伝学を参照する。

NGSの流れと市販のパネル

授業のNGSの品質管理 quality control 品質管理（quality control） quality control（品質管理） の図は、ライブラリ作製（入力の確認・断片化fragmentation 断片化（fragmentation）fragmentation（断片化） と末端修復・アダプター連結・サイズ選択・定量。各段に分光光度計 spectrophotometer分光光度計（spectrophotometer） spectrophotometer（分光光度計）・キャピラリー電気泳動capillary electrophoresisキャピラリー電気泳動（capillary electrophoresis）capillary electrophoresis（キャピラリー電気泳動）・蛍光定量・qPCRなどの確認点）、テンプレートtemplate (needle guide grid) テンプレート（template (needle guide grid)）template (needle guide grid)（テンプレート） の調製と濃縮、シークエンスsequenceシークエンス（sequence）sequence（シークエンス）、データ解析（データ品質の確認）の4段で、解析も生の読み取り → 多重化したサンプルの分離 → 参照への整列 → 標的の絞り込み → 品質の絞り込み → 深さの確認 → 解析可能な読み取りと進み、SNV・小さな挿入欠失・コピー数copy number コピー数（copy number）copy number（コピー数） の呼び出しを経て、フィルタリング・注釈・臨床グレードの知識ベースで解釈用の報告にまとめる。授業が別に示すGATKのベストプラクティス（2016年6月）は、参照への整列・重複の印付け・塩基の再校正 proofreading校正（proofreading） proofreading（校正）、バリアント呼び出しと共同の遺伝型 genotype 遺伝型（genotype） genotype（遺伝型） 決定、遺伝型genotype 遺伝型（genotype）genotype（遺伝型） の精密化・注釈・呼び出し結果の評価の3段である。

NGSの検査を診断に使うための流れは、授業の図では検査の開発（条件・試料調製・解析のフィルター filter フィルター（filter） filter（フィルター） と閾値・カバレッジの最適化と手順書）→ 妥当性validity 妥当性（validity）validity（妥当性） の確認（正確さ・精度・分析感度と特異度・報告範囲・基準範囲reference range基準範囲（reference range）reference range（基準範囲）、インデルindelインデル（indel）indel（インデル）・SNV・コピー数copy numberコピー数（copy number）copy number（コピー数）・再配列、疾患に特異的な試料）→ 検査と報告（インフォームドコンセント・偶発的所見・意義不明のバリアントvariant of uncertain significance (VUS)意義不明のバリアント（variant of uncertain significance (VUS)）variant of uncertain significance (VUS)（意義不明のバリアント））→ 継続的な品質管理 quality control 品質管理（quality control） quality control（品質管理） （確認検査confirmatory test確認検査（confirmatory test）confirmatory test（確認検査）・精度管理・外部精度評価）の4段である。

結果の確認と、NGSの性能

授業の原則は「スクリーニング法の結果は必ず確認し、臨床像と合わなければ追加の検査をする」である。NGSの変異もサンガー法 Sanger sequencing サンガー法（Sanger sequencing） Sanger sequencing（サンガー法） で確認するのが従来の標準だが、大規模genome mutation 大規模（genome mutation）genome mutation（大規模） な検討では確認率が99.965%で、1回のサンガー法 Sanger sequencing サンガー法（Sanger sequencing） Sanger sequencing（サンガー法） は真の変異を誤って否定しやすく、ルーチンの確認は不要とされた（品質が低いものは別）³。授業は、10回を超える読み取りの変異がサンガー法 Sanger sequencing サンガー法（Sanger sequencing） Sanger sequencing（サンガー法） で確認できたと述べる。

エクソームexome エクソーム（exome）exome（エクソーム） の比較（授業）では、サンガー法Sanger sequencing サンガー法（Sanger sequencing）Sanger sequencing（サンガー法） で既知の変異（SDHB・SDHC・SDHD）がある10検体（家系1の3人のうち父は野生型）が両方のプラット rat ラット（rat） rat（ラット） フォームで確認され、変異アレルmutant allele 変異アレル（mutant allele）mutant allele（変異アレル） の読み取りの比は約0.37〜0.57だった。ほかに見つかった変化は、EGLN1の挿入（サンガー法Sanger sequencing サンガー法（Sanger sequencing）Sanger sequencing（サンガー法） で確認できず偽陽性）、rs12097901（検出できず偽陰性）、KIF1BやRETの有害と予測される稀なバリアントなどで、偽陰性はGC含量の高い領域やコピー数変化 copy number alteration コピー数変化（copy number alteration） copy number alteration（コピー数変化） に関連し、フィルタリングで偽陽性は減らせる。表現型を修飾する可能性のあるバリアントも見つかり、データを再評価すれば後から変異を見つけられる。ただし褐色細胞腫 pheochromocytoma褐色細胞腫（pheochromocytoma） pheochromocytoma（褐色細胞腫）・傍神経節腫paraganglioma 傍神経節腫（paraganglioma）paraganglioma（傍神経節腫） でのエクソーム exome エクソーム（exome） exome（エクソーム） の分析性能を系統的に評価した研究は無い（授業）。エクソームexome エクソーム（exome）exome（エクソーム） は、MAX・MDH2・ATRX（体細胞）など新しい素因遺伝子 predisposing gene 素因遺伝子（predisposing gene） predisposing gene（素因遺伝子） の発見に使われた。

実例：褐色細胞腫・傍神経節腫

遺伝性が多く、授業は内分泌の遺伝学的検査の対象として、MEN1・MEN2・VHL・遺伝性褐色細胞腫 pheochromocytoma褐色細胞腫（pheochromocytoma） pheochromocytoma（褐色細胞腫）／傍神経節腫paraganglioma 傍神経節腫（paraganglioma）paraganglioma（傍神経節腫） に加え、21-水酸化酵素21-hydroxylase 21-水酸化酵素（21-hydroxylase）21-hydroxylase（21-水酸化酵素） 欠損、17α-水酸化酵素／17,20-リアーゼ17,20-lyase 17,20-リアーゼ（17,20-lyase）17,20-lyase（17,20-リアーゼ） 欠損、PROP1による複合型下垂体機能低下、CaSRによる家族性低カルシウム尿性高カルシウム血症 familial hypocalciuric hypercalcemia 家族性低カルシウム尿性高カルシウム血症（familial hypocalciuric hypercalcemia） familial hypocalciuric hypercalcemia（家族性低カルシウム尿性高カルシウム血症） を挙げる。

いずれも常染色体顕性 autosomal dominant 常染色体顕性（autosomal dominant） autosomal dominant（常染色体顕性） である。日本のガイドラインは20〜40%が遺伝性（小児は70〜80%）、SDHB変異SDHB mutation SDHB変異（SDHB mutation）SDHB mutation（SDHB変異） は35〜75%で転移するとし、頭頸部傍神経節腫head and neck paraganglioma 頭頸部傍神経節腫（head and neck paraganglioma）head and neck paraganglioma（頭頸部傍神経節腫） は全例で検査を勧める⁶。授業のハンガリー93例では22例（24%）に生殖細胞系列変異 germline mutation 生殖細胞系列変異（germline mutation） germline mutation（生殖細胞系列変異） （SDHB 6・RET 4・VHL 4・TMEM127 3・SDHD 2・NF1 2・SDHC 1）があり、SDHBは6例中3例が悪性で、遺伝性の群は両側・多発が50%だった（授業の「非遺伝性non-hereditary 非遺伝性（non-hereditary）non-hereditary（非遺伝性） 0.4%」は3/71＝約4%の計算誤り）。

Endocrine Societyは、すべての患者が共同意思決定 shared decision-making 共同意思決定（shared decision-making） shared decision-making（共同意思決定） のもとで遺伝子検査 genetic testing 遺伝子検査（genetic testing） genetic testing（遺伝子検査） を受け、臨床像に基づく診断の流れで優先順位を決め、傍神経節腫paraganglioma 傍神経節腫（paraganglioma）paraganglioma（傍神経節腫） ではSDHx、転移のある例ではSDHBを調べ、検査は医療の枠内で検査前後のカウンセリング counseling カウンセリング（counseling） counseling（カウンセリング） を提供し、認定された検査室で行うことを勧める⁷。日本では検査は遺伝カウンセリングの後に本人の希望で行い、髄様癌medullary carcinoma 髄様癌（medullary carcinoma）medullary carcinoma（髄様癌） を除いて保険の対象外である⁶。授業が再掲した、臨床像に基づく優先順位は次のとおりである。

従来の標準（PCR＋サンガー法 Sanger sequencingサンガー法（Sanger sequencing） Sanger sequencing（サンガー法）、大きな欠失はMLPA）では、RET・VHL・SDHB・SDHDだけで約2,700米ドル（授業の数値）かかり、15遺伝子（RET・VHL・SDHA・SDHAF2・SDHB・SDHC・SDHD・NF1・MAX・TMEM127・FH・MDH2・KIF1B・PHD2・EPAS）を調べるのが負担であったため、NGSが使われる。

症例（授業）：33歳、高血圧・動悸palpitations動悸（palpitations）palpitations（動悸）・発汗、家族歴は高血圧、尿中カテコールアミン代謝物urinary catecholamine metabolites 尿中カテコールアミン代謝物（urinary catecholamine metabolites）urinary catecholamine metabolites（尿中カテコールアミン代謝物） が1回高値、CT・MRIは陰性でPETが陽性。RETは「若年でカテコールアミン産生」だが髄様癌 medullary carcinoma髄様癌（medullary carcinoma） medullary carcinoma（髄様癌）・副甲状腺機能亢進症hyperparathyroidism 副甲状腺機能亢進症（hyperparathyroidism）hyperparathyroidism（副甲状腺機能亢進症） がなくMEN2は考えにくく、VHL（2型）や、傍神経節腫paraganglioma傍神経節腫（paraganglioma）paraganglioma（傍神経節腫）・褐色細胞腫pheochromocytoma 褐色細胞腫（pheochromocytoma）pheochromocytoma（褐色細胞腫） と家族歴だけのSDHB・SDHDを考え、SDHDのフレームシフト c.147_148insAフレームシフト（c.147_148insA） c.147_148insA（フレームシフト）で遺伝性傍神経節腫 paraganglioma傍神経節腫（paraganglioma） paraganglioma（傍神経節腫）・褐色細胞腫pheochromocytoma 褐色細胞腫（pheochromocytoma）pheochromocytoma（褐色細胞腫） 症候群と確定した。

遺伝子が確定すれば、変異陽性者は定期的なスクリーニング（カテコールアミン代謝物・画像）、一等親の血縁者 blood relative 血縁者（blood relative） blood relative（血縁者） には変異の検査を行い、血縁者blood relative 血縁者（blood relative）blood relative（血縁者） が変異陰性なら追跡は不要とされる（家系の変異が確定している場合の話で、発端者proband 発端者（proband）proband（発端者） に変異が見つからないときは血縁者 blood relative 血縁者（blood relative） blood relative（血縁者） を陰性とは言えない：標準的な知識）。

偶発的所見と報告

授業が示す2011年の分類は、エクソームexome エクソーム（exome）exome（エクソーム） で見つかる所見を臨床的有用性と妥当性 validity 妥当性（validity） validity（妥当性） で分ける。

現行のACMGの二次的所見 secondary finding 二次的所見（secondary finding） secondary finding（二次的所見） のリスト（v3.3）にも、SDHD・SDHAF2・SDHC・SDHB・MAX・TMEM127・RET・VHLが含まれ、病的と病的の疑いを報告し、意義不明はどの遺伝子でも報告しない⁸。意義不明のバリアントvariant of uncertain significance (VUS) 意義不明のバリアント（variant of uncertain significance (VUS)）variant of uncertain significance (VUS)（意義不明のバリアント） を臨床の判断の根拠にしないことも原則である（標準的な知識）。同意と偶発的所見・意義不明の扱いは検査の前に決める。ホルモン側の検査は内分泌疾患の臨床検査を参照する。

• 関連ノート：腫瘍マーカーtumor markers腫瘍マーカー（tumor markers）tumor markers（腫瘍マーカー）を参照する。

まとめ

• 検査は、既知の変異（アレル特異的PCRallele-specific PCRアレル特異的PCR（allele-specific PCR）allele-specific PCR（アレル特異的PCR）・TaqMan）、未知の変異（シークエンスsequenceシークエンス（sequence）sequence（シークエンス）・NGSパネル）、コピー数copy number コピー数（copy number）copy number（コピー数） （リアルタイムPCRreal-time PCRリアルタイムPCR（real-time PCR）real-time PCR（リアルタイムPCR）・MLPA）で使い分ける。SSCP・DGGE・DHPLCなどのスクリーニング法は、シークエンスsequence シークエンス（sequence）sequence（シークエンス） とNGSに置き換わった。
• 結果は変異・多型の頻度ではなく、病的〜良性の5段階で報告する。NGSの成績は解析ソフトと領域（GC含量・偽遺伝子pseudogene偽遺伝子（pseudogene）pseudogene（偽遺伝子）・コピー数copy numberコピー数（copy number）copy number（コピー数））で変わり、品質の低い変異は確認し、意義不明は報告や判断の根拠にしない。
• 褐色細胞腫pheochromocytoma褐色細胞腫（pheochromocytoma）pheochromocytoma（褐色細胞腫）・傍神経節腫paraganglioma 傍神経節腫（paraganglioma）paraganglioma（傍神経節腫） は20〜40%が遺伝性で、臨床像（転移・部位・産生ホルモン）から調べる遺伝子の順を決め、遺伝カウンセリングと血縁者 blood relative 血縁者（blood relative） blood relative（血縁者） の検査につなぐ。