ゲノミクスの手法

🧠 この講義は「遺伝マーカーgenetic markers 遺伝マーカー（genetic markers）genetic markers（遺伝マーカー） →連鎖・ハプロタイプhaplotype ハプロタイプ（haplotype）haplotype（ハプロタイプ） →仮説駆動型 hypothesis-driven仮説駆動型（hypothesis-driven） hypothesis-driven（仮説駆動型）/仮説フリー型hypothesis-free 仮説フリー型（hypothesis-free）hypothesis-free（仮説フリー型） 研究→3世代のシーケンシング技術→動物モデル animal models動物モデル（animal models） animal models（動物モデル）」という、複合疾患complex disease 複合疾患（complex disease）complex disease（複合疾患） の遺伝的背景 genetic background 遺伝的背景（genetic background） genetic background（遺伝的背景） を探る実際のツールキットを俯瞰する構成で読む。 各技術には固有の強み・弱みがあり、「何を検出したいか」によって適切な世代のシーケンシング・適切な研究デザイン study design 研究デザイン（study design） study design（研究デザイン） を選び分ける判断力が問われる。

遺伝マーカー

遺伝マーカーgenetic markers遺伝マーカー（genetic markers）genetic markers（遺伝マーカー）＝染色体上の既知の位置をもち、相同染色体homologous chromosomes 相同染色体（homologous chromosomes）homologous chromosomes（相同染色体） 上の異なる対立遺伝子を高い確率で識別できる配列バリアント sequence variant配列バリアント（sequence variant） sequence variant（配列バリアント）。

組換え頻度と遺伝的距離

F2世代（孫世代）： 相同組換えhomologous recombination 相同組換え（homologous recombination）homologous recombination（相同組換え） の結果、祖父母4人分のゲノムが孫の染色体上でモザイク状 mosaic pattern モザイク状（mosaic pattern） mosaic pattern（モザイク状） に混在する（3人分の色が見えても4人目の祖父母分は検出されないこともある）。

2つの遺伝子座間の組換え頻度は、一般に物理的距離 physical distance 物理的距離（physical distance） physical distance（物理的距離） とともに増える： 1%の組換え確率＝1センチモルガン centimorgan センチモルガン（centimorgan） centimorgan（センチモルガン） （cM）である。ただし1 cM≈1 Mbはヒトゲノム全体での粗い平均的目安にすぎず、局所領域・性別・集団・個人によって組換え率は大きく変動する。²

ハプロタイプと連鎖不平衡

ハプロタイプhaplotype ハプロタイプ（haplotype）haplotype（ハプロタイプ） ： 隣接する複数の対立遺伝子が異なる個体間で頻繁に同時に受け継がれる（それらの間で交差組換えがきわめて稀）場合、それらは同一ハプロタイプ haplotype ハプロタイプ（haplotype） haplotype（ハプロタイプ） 上にあるという。祖先ハプロタイプ haplotype ハプロタイプ（haplotype） haplotype（ハプロタイプ） は、その後の減数分裂での交差により変化していく——鎌状赤血球症の原因変異は少なくとも7,300年前に生じたと推定され、その周辺の少数のマーカー（T・Cアレル等）だけが確実な指標として残っている。

⭐ 連鎖不平衡linkage disequilibrium, LD 連鎖不平衡（linkage disequilibrium, LD）linkage disequilibrium, LD（連鎖不平衡） は「2つの遺伝子座が独立に遺伝していない」ことを示す指標。 染色体上で近接する2つの遺伝子座が独立に遺伝しない状態——集団内での分布が無作為ではない。標準化LD係数D′・相関係数correlation coefficient相関係数（correlation coefficient）correlation coefficient（相関係数）r²で定量化され、いずれも0＝平衡（2つの対立遺伝子が異なる染色体上にある等）、1＝完全なLD（2つの対立遺伝子が常に隣接）を意味する（06-1-population-geneticsのGWAS解釈も参照）。

疾患の遺伝的背景を探る研究手法

候補遺伝子関連解析candidate gene association 候補遺伝子関連解析（candidate gene association）candidate gene association（候補遺伝子関連解析） （仮説駆動型hypothesis-driven 仮説駆動型（hypothesis-driven）hypothesis-driven（仮説駆動型） 手法）： 候補遺伝子candidate gene 候補遺伝子（candidate gene）candidate gene（候補遺伝子） の選定基準は、①既知の代謝経路に関わるタンパクの遺伝子、②ゲノムスクリーニングにより選定された遺伝子——変異が疾患の発症・症状に影響するかを、集団遺伝学population genetics集団遺伝学（population genetics）population genetics（集団遺伝学）・動物実験animal testing 動物実験（animal testing）animal testing（動物実験） で検証する（05-2-complex-inheritance-i参照）。一方、現在の複合形質研究ではGWASなどの全ゲノム規模の探索も広く用いられる。¹

GWAS（仮説フリー型hypothesis-free 仮説フリー型（hypothesis-free）hypothesis-free（仮説フリー型） の代表）： 10万個超の遺伝的バリアントを一度に検査する、複合疾患complex disease複合疾患（complex disease）complex disease（複合疾患）・形質の遺伝的背景 genetic background 遺伝的背景（genetic background） genetic background（遺伝的背景） を調べる最も一般的な手法（06-1-population-genetics参照）。

シーケンシング技術の3世代

第1世代：サンガー法

DNA断片のヌクレオチド配列を決定する。サンガー法Sanger sequencing サンガー法（Sanger sequencing）Sanger sequencing（サンガー法） （鎖終結法chain-termination method鎖終結法（chain-termination method）chain-termination method（鎖終結法））が広く普及——蛍光標識ジデオキシヌクレオチド fluorescently labeled dideoxynucleotide (ddNTP) 蛍光標識ジデオキシヌクレオチド（fluorescently labeled dideoxynucleotide (ddNTP)） fluorescently labeled dideoxynucleotide (ddNTP)（蛍光標識ジデオキシヌクレオチド） とキャピラリー電気泳動 capillary electrophoresis キャピラリー電気泳動（capillary electrophoresis） capillary electrophoresis（キャピラリー電気泳動） による自動化により、1反応で1配列（約800塩基）を決定できる。1塩基差の断片も識別可能な高分解能 high resolution, HR 高分解能（high resolution, HR） high resolution, HR（高分解能） をもつ。

第2世代：次世代シーケンシング

数百万本の短い（100〜500bp）DNA断片を並列にシーケンシングする（合成による配列決定、sequencing by synthesis）——高精度。

PheWAS vs GWAS：

両者ともマンハッタンプロット Manhattan plot マンハッタンプロット（Manhattan plot） Manhattan plot（マンハッタンプロット） で結果を可視化する（06-1-population-genetics参照）。

第3世代：ロングリードシーケンシング

数万塩基以上に及ぶ長いDNA配列を決定できる。ナノポアシーケンシングnanopore sequencingナノポアシーケンシング（nanopore sequencing）nanopore sequencing（ナノポアシーケンシング）ではDNA鎖を膜上の微小孔（ナノポアnanoporeナノポア（nanopore）nanopore（ナノポア））に直接通し、電流変化から塩基配列を読む。PacBioシーケンシングでは環状化した同一分子を反復して読む方式により高精度化できる。精度とリード長は装置・ライブラリ調製・解析法の進歩で変化するため、固定した単一の数値では表さない。³

⭐ 第3世代シーケンシングの最大の強みは「単一分子の長い範囲を読めること」と「反復配列repetitive sequence 反復配列（repetitive sequence）repetitive sequence（反復配列） に強いこと」。 PCR増幅を省ける方式では増幅バイアス bias バイアス（bias） bias（バイアス） を避けやすく、短いリードからの組み立てが難しい反復配列 repetitive sequence 反復配列（repetitive sequence） repetitive sequence（反復配列） や構造変異 structural variant 構造変異（structural variant） structural variant（構造変異） を直接またいで解読できる——セントロメア centromere セントロメア（centromere） centromere（セントロメア） 領域・端部動原体染色体acrocentric chromosome 端部動原体染色体（acrocentric chromosome）acrocentric chromosome（端部動原体染色体） の短腕 p arm 短腕（p arm） p arm（短腕） は2021年まで解読困難だったが（T2Tコンソーシアム、07-1-introduction-to-genomics参照）、ロングリード技術が解決に大きく寄与した。ハプロタイプhaplotype ハプロタイプ（haplotype）haplotype（ハプロタイプ） の決定は短いリードでも統計的・家系情報を用いて可能だが、ロングリードでは同一分子上の離れたバリアントを直接位相決定しやすい——HLAハプロタイプ haplotype ハプロタイプ（haplotype） haplotype（ハプロタイプ） と1型糖尿病リスクの関連解析 association studies 関連解析（association studies） association studies（関連解析） にも応用できる。⁴

3世代の使い分け： ロングリード法にはコスト・データ解析・高分子量high molecular weight 高分子量（high molecular weight）high molecular weight（高分子量） DNAを保つ試料調製などの課題があるが、新鮮fresh 新鮮（fresh）fresh（新鮮） 検体だけに限定されるわけではない。①単一遺伝子の標的シーケンシングには第1世代、②大量・網羅的シーケンシングには第2世代、③反復配列 repetitive sequence反復配列（repetitive sequence） repetitive sequence（反復配列）・ハプロタイプhaplotypeハプロタイプ（haplotype）haplotype（ハプロタイプ）・構造変異structural variant 構造変異（structural variant）structural variant（構造変異） には第3世代、と用途に応じて使い分ける。⁴³

エピジェネティクスの検出

エピジェネティックepigenetic エピジェネティック（epigenetic）epigenetic（エピジェネティック） 調節異常： がん抑制遺伝子tumor suppressor geneがん抑制遺伝子（tumor suppressor gene）tumor suppressor gene（がん抑制遺伝子）・ミューテーター遺伝子mutator gene ミューテーター遺伝子（mutator gene）mutator gene（ミューテーター遺伝子） の高メチル化 hypermethylation 高メチル化（hypermethylation） hypermethylation（高メチル化） （例：大腸がんの40%でp16遺伝子がメチル化）、がん遺伝子の低メチル化 hypomethylation 低メチル化（hypomethylation） hypomethylation（低メチル化） （03-2-epigenetics参照）。全ゲノムバイサルファイトシーケンシングwhole-genome bisulfite sequencing (WGBS)全ゲノムバイサルファイトシーケンシング（whole-genome bisulfite sequencing (WGBS)）whole-genome bisulfite sequencing (WGBS)（全ゲノムバイサルファイトシーケンシング）：バイサルファイト変換でシトシンをウラシル uracil ウラシル（uracil） uracil（ウラシル） に変換する一方、5-メチルシトシンは変換されないまま残る——変換前後の配列を比較し、シトシンのまま残った部位がメチル化部位と判定される。

全ゲノム遺伝子発現解析 gene expression analysis 遺伝子発現解析（gene expression analysis） gene expression analysis（遺伝子発現解析） ： マイクロアレイmicroarray マイクロアレイ（microarray）microarray（マイクロアレイ） （例：44kチップで44,000種のmRNA発現量を同時測定）。

動物モデル

遺伝子改変動物GM animals 遺伝子改変動物（GM animals）GM animals（遺伝子改変動物） ： ノックアウトマウスknockout mouse ノックアウトマウス（knockout mouse）knockout mouse（ノックアウトマウス） （遺伝子不活化による疾患モデル作製、遺伝子機能研究）、トランスジェニックマウスtransgenic mouse トランスジェニックマウス（transgenic mouse）transgenic mouse（トランスジェニックマウス） （疾患モデル、遺伝子機能研究）、生体内in vivo 生体内（in vivo）in vivo（生体内） 遺伝子改変（CRISPR/Cas9、12-1-gene-therapy参照）。

💡 ENU変異誘発は「まず変異を大量に作ってから、表現型で選別する」という逆方向のアプローチ。 ENU（エチルニトロソ尿素）は雄マウスに変異を誘導し、野生型雌と交配——G1世代を優性変異についてスクリーニングできるが、劣性変異recessive variant 劣性変異（recessive variant）recessive variant（劣性変異） の場合はG1雄由来のG3世代でホモ接合個体を回収する必要がある。

まとめ

• 遺伝マーカーgenetic markers 遺伝マーカー（genetic markers）genetic markers（遺伝マーカー） はマイクロサテライト microsatellite マイクロサテライト（microsatellite） microsatellite（マイクロサテライト） （STR、高度に多型）とSNP（多数・集団遺伝学population genetics 集団遺伝学（population genetics）population genetics（集団遺伝学） 向け）に大別され、組換え頻度とハプロタイプ haplotypeハプロタイプ（haplotype） haplotype（ハプロタイプ）・連鎖不平衡linkage disequilibrium, LD 連鎖不平衡（linkage disequilibrium, LD）linkage disequilibrium, LD（連鎖不平衡） （LD）の概念が遺伝子マッピングの基盤になる。1 cM≈1 Mbは局所差を無視 neglect 無視（neglect） neglect（無視） した粗い目安である。
• 疾患の遺伝的背景 genetic background 遺伝的背景（genetic background） genetic background（遺伝的背景） 研究は仮説駆動型 hypothesis-driven 仮説駆動型（hypothesis-driven） hypothesis-driven（仮説駆動型） （候補遺伝子関連解析candidate gene association候補遺伝子関連解析（candidate gene association）candidate gene association（候補遺伝子関連解析））と仮説フリー型 hypothesis-free 仮説フリー型（hypothesis-free） hypothesis-free（仮説フリー型） （GWAS）に大別され、ウェットラボwet lab ウェットラボ（wet lab）wet lab（ウェットラボ） 手法とインシリコ手法 in silico methods インシリコ手法（in silico methods） in silico methods（インシリコ手法） （データベース解析・メタ解析Meta-analysisメタ解析（Meta-analysis）Meta-analysis（メタ解析））を組み合わせる。
• シーケンシングは第1世代（サンガー法Sanger sequencingサンガー法（Sanger sequencing）Sanger sequencing（サンガー法）、高精度・低スループット）→第2世代（NGS、WES/WGS/RNA-seq/メタゲノミクスmetagenomicsメタゲノミクス（metagenomics）metagenomics（メタゲノミクス）/ChIP-seq等、高スループット）→第3世代（ロングリード、PCR不要・反復配列repetitive sequence 反復配列（repetitive sequence）repetitive sequence（反復配列） とハプロタイプ haplotype ハプロタイプ（haplotype） haplotype（ハプロタイプ） に強い）と進化し、それぞれ異なる用途に使い分けられる。PheWASはGWASの「逆方向」の問いを立てる手法。
• WGBSはメチル化検出の標準手法、マイクロアレイmicroarray マイクロアレイ（microarray）microarray（マイクロアレイ） は網羅的遺伝子発現解析 gene expression analysis 遺伝子発現解析（gene expression analysis） gene expression analysis（遺伝子発現解析） に用いられる。動物モデルanimal models 動物モデル（animal models）animal models（動物モデル） はマウスを中心に多くの利点をもつが病態機序・ゲノムレベルの相違という限界があり、ノックアウトknock-outノックアウト（knock-out）knock-out（ノックアウト）/トランスジェニック技術・ENU変異誘発がその作製法。