常染色体劣性遺伝（AR II）

🧠 前半（CF・ヘモグロビン異常症Hemoglobinopathiesヘモグロビン異常症（Hemoglobinopathies）Hemoglobinopathies（ヘモグロビン異常症））は「同じ疾患カテゴリーの中でも変異の組み合わせが表現型の重症度を決める」ことを、後半（エピスタシスepistasisエピスタシス（epistasis）epistasis（エピスタシス）・RNARNA（ribonucleic acid）診断法）は「遺伝子間の相互作用」と「DNADNA（deoxyribonucleic acid）診断を超えたRNAレベルの診断技術」を扱う——04-6-autosomal-recessive-inheritance-ar-iの続編として読む。 締めくくりの症例ギャラリー facultative case gallery 症例ギャラリー（facultative case gallery） facultative case gallery（症例ギャラリー） は、WES・MLPAMLPA（multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)）・電気泳動判読という実技を多様な疾患に適用する総仕上げ。

症例：嚢胞性線維症

CFTR遺伝子（CF膜貫通コンダクタンス conductance コンダクタンス（conductance） conductance（コンダクタンス） 制御因子 regulatory factor制御因子（regulatory factor） regulatory factor（制御因子））のイオンチャネル変異——04-1-monogenic-inheritanceで扱った基礎に加え、ここでは診断技術に焦点を当てる。CFTRには多数の変異があり（対立遺伝子異質性allelic heterogeneity対立遺伝子異質性（allelic heterogeneity）allelic heterogeneity（対立遺伝子異質性））、F508del（508番目のフェニルアラニン phenylalanine フェニルアラニン（phenylalanine） phenylalanine（フェニルアラニン） をコードするトリプレットの欠失）は多くの集団で高頻度だが、変異スペクトラムと頻度は集団ごとに異なる。¹

診断アルゴリズム：

flowchart TD
  A["CF疑い患者"]
  A --> B["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='study population'>対象集団</span>に合わせた頻用変異パネル"]
  B -->|"病的変異が2つ確認され、<span class='jp-term jp-term-diagram' title='clinical signs'>臨床所見</span>と整合"| C["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='molecular diagnostics'>分子診断</span>を支持"]
  B -->|"0〜1変異または未解決"| D["NGSによるCFTR<span class='jp-term jp-term-diagram' title='sequence analysis'>配列解析</span>"]
  D -->|"なお未解決"| E["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)'>MLPA</span>等で欠失・重複を評価"]

頻用変異パネルからNGS、さらにコピー数 copy number コピー数（copy number） copy number（コピー数） 解析へ進む順序は、対象集団study population 対象集団（study population）study population（対象集団） の変異頻度と既往検査に合わせて設計する。劣性疾患であるため、F508delが1アレルに見つかっただけで診断確定とはせず、臨床診断・機能検査functional test 機能検査（functional test）functional test（機能検査） と両アレルの評価を統合する。¹

NGS解析の実際： 複数のオーバーラップするアンプリコン amplicon アンプリコン（amplicon） amplicon（アンプリコン） でCFTR遺伝子全体をペアエンド paired-end ペアエンド（paired-end） paired-end（ペアエンド） でシーケンスし、リード深度（read depth／coverage）と変異アレル頻度 variant allele frequency 変異アレル頻度（variant allele frequency） variant allele frequency（変異アレル頻度） を評価する。十分な深度が得られた二倍体 diploid 二倍体（diploid） diploid（二倍体） の生殖細胞系列解析では、変異リードはヘテロ接合体 heterozygote ヘテロ接合体（heterozygote） heterozygote（ヘテロ接合体） で約50%、ホモ接合体homozygote ホモ接合体（homozygote）homozygote（ホモ接合体） でほぼ100%が目安となるが、増幅バイアス biasバイアス（bias） bias（バイアス）、低深度、モザイク、コピー数変化copy number alteration コピー数変化（copy number alteration）copy number alteration（コピー数変化） などでずれうるため、この比率だけで遺伝子型を確定しない。

⚠️ NGSは「病的変異」と「ただの多様体」を区別しない——臨床的意義の判定には専用データベースが必要。 NGSはCFTR遺伝子のあらゆるバリアントを検出するが、病原性の有無は自動的にはわからない——CFTR2（https://cftr2.org/）のような臨床機能データベースを参照して初めて、検出された変異の臨床的意義を判定できる。

症例：ヘモグロビン異常症

鎌状赤血球症

症状： 貧血（脱力・頭痛・呼吸困難を伴う）、溶血（黄疸・腹痛・脾腫を伴う）。ヘテロ接合体優位性heterozygote advantageヘテロ接合体優位性（heterozygote advantage）heterozygote advantage（ヘテロ接合体優位性）が知られる（マラリア抵抗性、08-2-evolution-genetics参照）。

PCRPCR（polymerase chain reaction）-RFLP診断： ①DNA増幅、②制限酵素 restriction endonuclease 制限酵素（restriction endonuclease） restriction endonuclease（制限酵素） 消化、③電気泳動、④エチジウムブロマイド染色、という4段階。ヘモグロビンS（HbS）の変異は特定の制限酵素 restriction endonuclease 制限酵素（restriction endonuclease） restriction endonuclease（制限酵素） 認識部位を消失させる——正常アレル（A）は消化されて160bp＋80bpに、変異アレルmutant allele 変異アレル（mutant allele）mutant allele（変異アレル） （S）は切断されず未消化のまま残る、という長さの違いでジェノタイプを判定する。

サラセミア

症状： 溶血性貧血、黄疸、脾腫、骨格異常skeletal abnormality骨格異常（skeletal abnormality）skeletal abnormality（骨格異常）、輸血による鉄過剰。

⭐ サラセミアThalassemias サラセミア（Thalassemias）Thalassemias（サラセミア） の出生前診断 prenatal diagnosis 出生前診断（prenatal diagnosis） prenatal diagnosis（出生前診断） 法は、家系内変異の種類と対象集団 study population 対象集団（study population） study population（対象集団） に合わせて選ぶ。 点変異・小さな挿入欠失には標的PCRやサンガー法 Sanger sequencingサンガー法（Sanger sequencing） Sanger sequencing（サンガー法）、大きな欠失・重複にはコピー数 copy number コピー数（copy number） copy number（コピー数） 解析などを組み合わせる。ロングリード法は従来法で見逃される複雑な変異を追加検出しうるが、病的変異はPCR・サンガー法Sanger sequencing サンガー法（Sanger sequencing）Sanger sequencing（サンガー法） など異なる原理の検査で確認する。² サンガー法Sanger sequencing サンガー法（Sanger sequencing）Sanger sequencing（サンガー法） では、ヘテロ接合体heterozygote ヘテロ接合体（heterozygote）heterozygote（ヘテロ接合体） の変異位置以降に重なったピークが現れることがある。

エピスタシス：劣性形質の発現を左右する遺伝子間相互作用

定義： 2つ以上の遺伝子が1つの表現型に寄与する場合、それらの遺伝子は「エピスタティック」と呼ばれる——ある遺伝子座のホモ接合劣性遺伝子型が、別の遺伝子座の発現そのものを覆い隠す（マスクする）現象。相互作用する遺伝子群が同一経路の異なる段階をコードするケースが典型的。

⭐ チロシナーゼtyrosinase チロシナーゼ（tyrosinase）tyrosinase（チロシナーゼ） とPAHの変異が「毛色を決める遺伝子」を無意味にする——劣性エピスタシス epistasis エピスタシス（epistasis） epistasis（エピスタシス） の実例。 チロシナーゼtyrosinase チロシナーゼ（tyrosinase）tyrosinase（チロシナーゼ） 遺伝子・フェニルアラニン水酸化酵素phenylalanine hydroxylase, PAH フェニルアラニン水酸化酵素（phenylalanine hydroxylase, PAH）phenylalanine hydroxylase, PAH（フェニルアラニン水酸化酵素） 遺伝子のホモ接合劣性変異 recessive variant 劣性変異（recessive variant） recessive variant（劣性変異） は、それぞれメラニン合成経路（フェニルアラニンphenylalanine フェニルアラニン（phenylalanine）phenylalanine（フェニルアラニン） →チロシン→L-ドーパ→ドーパキノン quinone キノン（quinone） quinone（キノン） →メラニン）の上流をブロックする——毛色を決めるはずの下流遺伝子群の効果自体が発現しなくなる。「毛色遺伝子は正常でも、メラニン合成経路が根本から止まっていれば意味がない」というのが劣性エピスタシス epistasis エピスタシス（epistasis） epistasis（エピスタシス） の本質。

症例：ボンベイ式血液型

FUT1遺伝子（フコース転移酵素）のホモ接合劣性変異 recessive variant 劣性変異（recessive variant） recessive variant（劣性変異） により、ABO抗原 O antigen (somatic antigen) O抗原（O antigen (somatic antigen)） O antigen (somatic antigen)（O抗原） 合成の前駆体であるH抗原 H antigen H抗原（H antigen） H antigen（H抗原） 自体が作られない——ABO遺伝子型が正常であっても表現型上は「O型に見えるが実はO型でもない」特殊な型になる。頻度：インドで1万人に1人、ヨーロッパで100万人に1人。抗H・抗A・抗B抗体を産生するため、輸血はボンベイ型血液のみ可能。

FUT1活性が完全に欠けるBombay型に対し、活性や赤血球ABO(H)抗原の発現が弱く残る場合はpara-Bombay型となる。したがって「すべての血液型抗原 blood group antigen 血液型抗原（blood group antigen） blood group antigen（血液型抗原） が陰性」ではなく、赤血球表面のABO(H)抗原の欠如または弱発現として記述する。³

⚠️ ABO血液型ABO blood group ABO血液型（ABO blood group）ABO blood group（ABO血液型） は「多重対立遺伝子性multiple allelism 多重対立遺伝子性（multiple allelism）multiple allelism（多重対立遺伝子性） ＋共優性 codominant共優性（codominant） codominant（共優性）」の教材でもある。 単一遺伝子に3つの対立遺伝子（Iᴬ・Iᴮ・I⁰）があり、6つの遺伝子型が4つの表現型（O・A・B・AB）に対応する——IᴬとIᴮは共優性 codominant共優性（codominant） codominant（共優性）、I⁰は両者に対し劣性。親子鑑定paternity test 親子鑑定（paternity test）paternity test（親子鑑定） の演習： 母親（血液型A、IᴬI⁰）と夫（血液型AB、IᴬIᴮ）の間にO型（I⁰I⁰）の子が生まれた場合、夫は生物学的父ではありえない——I⁰アレルを夫はもたないため。

症例：眼の色のエピスタシス

ASIP・IRF4・SLC24A4・SLC24A5・SLC45A2・TPCN2・TYR・TYRP1という複数の遺伝子の効果が、OCA2・HERC2（01-1-introduction-to-human-geneticsの青い目の起源も参照）の発現調節と組み合わさり、連続的な眼の色のスペクトラムを生む——単一の「優性/劣性」では説明しきれない多遺伝子性 polygenic 多遺伝子性（polygenic） polygenic（多遺伝子性） エピスタシス epistasis エピスタシス（epistasis） epistasis（エピスタシス） の実例。

RNAベースの遺伝子診断法

💡 mRNAは不安定なので、まずcDNAに「変換」してから増幅する——これがRT-PCRRT-PCR（reverse transcription polymerase chain reaction）の核心。 逆転写PCR（RT-PCR：reverse transcription PCR）はmRNA検出のための手法——mRNAは不安定なため、逆転写酵素でcDNA（相補DNA）に変換してからPCR増幅する。スプライシング変異・発現量の変化・組織特異性の検出に応用される。

リアルタイム／定量PCR

従来のPCRを「リアルタイムで追跡」できるよう発展させた手法——蛍光測定によりPCR産物の増幅過程を定量的に追跡できる。DNA定量・RNA定量（qRT-PCR、遺伝子発現・ウイルスRNA測定等）の両方に応用される。ハウスキーピング遺伝子housekeeping gene ハウスキーピング遺伝子（housekeeping gene）housekeeping gene（ハウスキーピング遺伝子） （例：GAPDHGAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase））を内部標準として用い、検体間の比較を可能にする。

TaqManプローブの原理： プローブの片端に蛍光レポーター、もう片端にクエンチャー quencher クエンチャー（quencher） quencher（クエンチャー） （消光quenching 消光（quenching）quenching（消光） 団）を配置——両者が近接している間は蛍光が検出されない。プローブが標的配列に特異的にハイブリダイズした後、DNAポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性 exonuclease activity エキソヌクレアーゼ活性（exonuclease activity） exonuclease activity（エキソヌクレアーゼ活性） がプローブを分解し、レポーターとクエンチャー quencher クエンチャー（quencher） quencher（クエンチャー） が離れることで蛍光が測定可能になる。閾値サイクルthreshold cycle, Ct閾値サイクル（threshold cycle, Ct）threshold cycle, Ct（閾値サイクル）＝増幅曲線が閾値ラインと交差する点——初期鋳型量の指標になる。

臨床応用clinical applications 臨床応用（clinical applications）clinical applications（臨床応用） ： マルチプレックスRT-PCRによるSARS-CoV-2検出（ORF1ab・N遺伝子・S遺伝子・MS2内部対照を同時に検出、S遺伝子欠失により変異株 variant strain 変異株（variant strain） variant strain（変異株） をアレル特異的RT-qPCRでスクリーニング可能）。

感染性病原体の検出

総仕上げ：症例ギャラリー

セミナー末尾では、家系図pedigree家系図（pedigree）pedigree（家系図）・電気泳動写真・シーケンシング結果から遺伝子型を読み解く演習が多数の疾患にわたって行われる——いずれも「変異のタイプ（点変異・欠失・重複・モザイシズムmosaicismモザイシズム（mosaicism）mosaicism（モザイシズム））を、対応する分子診断 molecular diagnostics 分子診断（molecular diagnostics） molecular diagnostics（分子診断） 技術（Sanger法・NGS・MLPA）の出力からどう読み取るか」という実技力を問う。

💡 MLPA（マルチプレックス連結依存性プローブ増幅法）は「エクソン単位のコピー数 copy numberコピー数（copy number） copy number（コピー数）」を調べる手法。 通常のシーケンシングでは検出しにくいエクソン単位の欠失・重複を、複数のプローブを連結・増幅し電気泳動パターンの相対的なピーク高さから定量する——PKUPKU（phenylketonuria）のような疾患で、点変異では説明できない症例の原因を明らかにできる。

まとめ

• CFTR変異CFTR mutation CFTR変異（CFTR mutation）CFTR mutation（CFTR変異） スペクトラムは集団で異なり、頻用変異パネル→NGS→欠失・重複解析と段階的に評価する。単一のF508del検出だけで確定せず、臨床・機能所見と両アレルを統合する。
• 鎌状赤血球症ではPCR-RFLPの原理を学び、サラセミアThalassemias サラセミア（Thalassemias）Thalassemias（サラセミア） 出生前診断 prenatal diagnosis 出生前診断（prenatal diagnosis） prenatal diagnosis（出生前診断） では家系内変異に応じて標的検査、配列解析sequence analysis配列解析（sequence analysis）sequence analysis（配列解析）、コピー数copy number コピー数（copy number）copy number（コピー数） 解析、ロングリード法を選び、必要な直交確認を行う。
• エピスタシスepistasis エピスタシス（epistasis）epistasis（エピスタシス） は劣性ホモ接合遺伝子型が別遺伝子座の発現を覆い隠す現象で、チロシナーゼtyrosinase チロシナーゼ（tyrosinase）tyrosinase（チロシナーゼ） ×PAH（毛色）、FUT1×ABO遺伝子座（Bombay/para-Bombay型血液型）が代表例。ABO血液型ABO blood group ABO血液型（ABO blood group）ABO blood group（ABO血液型） 自体は多重対立遺伝子性 multiple allelism 多重対立遺伝子性（multiple allelism） multiple allelism（多重対立遺伝子性） ＋共優性 codominant 共優性（codominant） codominant（共優性） の教材として親子鑑定 paternity test 親子鑑定（paternity test） paternity test（親子鑑定） にも応用される。
• RT-PCR（mRNA→cDNA変換後に増幅）とリアルタイムPCR real-time PCR リアルタイムPCR（real-time PCR） real-time PCR（リアルタイムPCR） （TaqManプローブによる蛍光定量、Ct値cycle threshold valueCt値（cycle threshold value）cycle threshold value（Ct値））はRNAレベルでの遺伝子診断を可能にし、SARS-CoV-2検出のような感染症診断にも応用される。ネステッドPCRnested PCR ネステッドPCR（nested PCR）nested PCR（ネステッドPCR） は特異度を高める工夫。
• 症例ギャラリーfacultative case gallery 症例ギャラリー（facultative case gallery）facultative case gallery（症例ギャラリー） はHME・ALS・重症FH・periventricular heterotopia・先天性高インスリン血症congenital hyperinsulinism先天性高インスリン血症（congenital hyperinsulinism）congenital hyperinsulinism（先天性高インスリン血症）・Emery-Dreifuss様症候群・PKU（MLPA）を横断し、Sanger法・NGS・MLPAという診断技術の実践的判読力を養う。