Medical Microbiology · 4/3
真菌の培養。真菌感染症の微生物学的診断
Cultivation of fungi. Microbiological diagnosis of fungal infections
- 検査値
- KOH標本
🧠 真菌診断は「遅い培養」と「速い直接法」の二重構造で読む。 真菌は世代時間generation time世代時間（generation time）generation time（世代時間）が長く（培養に最短48時間、陰性確定に4週間）、待っている間に患者は待てないことが多い——だからこそKOH直接鏡検KOH direct microscopyKOH直接鏡検（KOH direct microscopy）KOH direct microscopy（KOH直接鏡検）・各種染色・血清抗原・PCRという「培養を待たない」手段が並走する。培養は25℃と37℃を並行して行う点も、4/1で学んだ二形性を検出するための工夫である。
真菌培養の基本原則
- 真菌は世代時間generation time世代時間（generation time）generation time（世代時間）が長く（増殖が遅い）、最短でも48時間かかる
- 陰性の判定は培養4週間を経てから初めて下せる
- 培養は好気条件で行う（真菌はすべて好気性生物）
- 通常、2種類の温度で並行培養し（二形性の検出のため）、非選択培地selective medium選択培地（selective medium）selective medium（選択培地）と選択培地selective medium選択培地（selective medium）selective medium（選択培地）を併用する
- 非選択培地selective medium選択培地（selective medium）selective medium（選択培地）：酵母・カビいずれの急速な増殖も許す
サブロー寒天培地
真菌用の標準寒天培地。
- 高濃度のデキストロース（4%）と5〜10%羊血液を含む
- 炭素源としてグルコース、窒素源としてペプトンを含む
- pHは酸性（4〜5）
- 細菌の増殖を抑えるため各種抗菌薬を添加する
- 酵母・カビどちらも本培地上で増殖できる → カビの増殖を抑えたい場合はシクロヘキシミドcycloheximideシクロヘキシミド（cycloheximide）cycloheximide（シクロヘキシミド）を添加する
| 培養条件 | 内容 |
|---|---|
| 酸素分圧partial pressure of oxygen酸素分圧（partial pressure of oxygen）partial pressure of oxygen（酸素分圧） | 好気性 |
| 温度 | 25℃と37℃を並行（二形性の検出！） |
| 期間 | 5日間、毎日発育を確認。酵母は48時間以内、カビは4〜5日（〜3週間）で発育 |
⚠️ クリプトコッカスCryptococcusクリプトコッカス（Cryptococcus）Cryptococcus（クリプトコッカス）を疑うときはシクロヘキシミドcycloheximideシクロヘキシミド（cycloheximide）cycloheximide（シクロヘキシミド）を入れない。 シクロヘキシミドcycloheximideシクロヘキシミド（cycloheximide）cycloheximide（シクロヘキシミド）はカビの発育を抑える目的で加えるが、Cryptococcus neoformans自体の発育も抑制してしまうため、培養する際はシクロヘキシミドcycloheximideシクロヘキシミド（cycloheximide）cycloheximide（シクロヘキシミド）無添加のサブロー培地Sabouraud agarサブロー培地（Sabouraud agar）Sabouraud agar（サブロー培地）を用いる。
その他の培地・手法
- Czapek寒天培地：真菌の培養全般に用いる
- TTC培地：さまざまな菌種が発育できる複合培地
- Rice tween寒天培地：Candida albicansの厚膜胞子chlamydospore厚膜胞子（chlamydospore）chlamydospore（厚膜胞子）の観察や、他菌種の胞子形成sporulation胞子形成（sporulation）sporulation（胞子形成）観察用のスライドslideスライド（slide）slide（スライド）培養作成に有用
- 寒天ベースの溶解遠心法lysis centrifugation method溶解遠心法（lysis centrifugation method）lysis centrifugation method（溶解遠心法）：酵母・カビ・二形性病原体による真菌血症fungemia真菌血症（fungemia）fungemia（真菌血症）の検出に用いる
- 培養は胞子または菌糸断片から開始できる。臨床検体は膿、血液、髄液、喀痰、組織生検、皮膚掻爬curettage掻爬（curettage）curettage（掻爬）検体など。同定は通常顕微鏡的に行う
検体採取
- 検体は無菌的に、または採取部位を適切に清拭・消毒した後に採取する
- 血液、皮膚、口腔、腟、髄液（CSF＝cerebrospinal fluid, 脳脊髄液）から採取可能
- 処理が遅れる場合は4℃で短期間保存すれば生存率survival生存率（survival）survival（生存率）は失われない
- 24時間蓄尿24-hour urine collection24時間蓄尿（24-hour urine collection）24-hour urine collection（24時間蓄尿）・蓄痰は有用でない——細菌・真菌の過増殖が起こるため
| 感染の種類 | 検体 |
|---|---|
| 表在性 | セロハンテープ法scotch/sticky tape testセロハンテープ法（scotch/sticky tape test）scotch/sticky tape test（セロハンテープ法） |
| 皮膚性 | 皮膚・爪の掻爬curettage掻爬（curettage）curettage（掻爬）検体 |
| 皮下性 | 皮膚生検 |
| 粘膜 | 食道生検（食道炎）、胃洗浄gastric lavage胃洗浄（gastric lavage）gastric lavage（胃洗浄）液（胃炎）、便（消化管感染症GI infections消化管感染症（GI infections）GI infections（消化管感染症））、尿（尿路感染症）、膀胱生検（尿路炎）、腟分泌物vaginal discharge腟分泌物（vaginal discharge）vaginal discharge（腟分泌物）（外陰腟炎vulvovaginitis外陰腟炎（vulvovaginitis）vulvovaginitis（外陰腟炎）） |
| 深在性deep-seated深在性（deep-seated）deep-seated（深在性）・全身性 | 血液（血液培養：心内膜炎・敗血症）、喀痰・気管支洗浄bronchial washing気管支洗浄（bronchial washing）bronchial washing（気管支洗浄）液（下気道感染症）、胸水（胸膜炎pleurisy胸膜炎（pleurisy）pleurisy（胸膜炎））、副鼻腔穿刺液（副鼻腔炎）、臓器生検（肝・脾・骨など）、腹水（腹膜炎）、髄液（中枢神経感染症） |
直接鏡検
- 最も迅速かつ低コストな診断手段の一つで、最適な培養法選択のガイドにもなる
- ネイティブ標本は10〜20%水酸化カリウム（KOH＝potassium hydroxide）溶液で前処理し、宿主組織の蛋白成分を溶かして真菌要素だけを見やすくする
- Wood灯Wood's lampWood灯（Wood's lamp）Wood's lamp（Wood灯）（紫外線）を用いた蛍光観察も行われる
| 染色法 | 用途 |
|---|---|
| Calcofluor-White染色 | 真菌細胞壁fungal cell wall真菌細胞壁（fungal cell wall）fungal cell wall（真菌細胞壁）（セルロースcelluloseセルロース（cellulose）cellulose（セルロース）・キチン）を検出。蛍光顕微鏡fluorescence microscope蛍光顕微鏡（fluorescence microscope）fluorescence microscope（蛍光顕微鏡）が必要 |
| Giemsa染色 | 細胞内Histoplasma capsulatum、およびPneumocystis jiroveciiの栄養型・シスト内型の両方を検出 |
| Gram染色 | ほとんどの酵母・菌糸要素を染色（真菌はすべて「グラム陽性」に染まる） |
| H&E染色 | ほとんどの真菌を染色し、感染組織の宿主反応host reaction宿主反応（host reaction）host reaction（宿主反応）も示す |
| PAS（Schiff）染色 | 酵母・菌糸細胞の両方を染色（真菌細胞が赤色に） |
| Gömöri（Grocott）銀染色silver staining銀染色（silver staining）silver staining（銀染色） | あらゆる真菌の検出に最も優れた染色法（銀含浸impregnation含浸（impregnation）impregnation（含浸）法） |
| ムチカルミン染色mucicarmine stainムチカルミン染色（mucicarmine stain）mucicarmine stain（ムチカルミン染色） | 莢膜物質capsular material莢膜物質（capsular material）capsular material（莢膜物質）の証明に有用 |
| メチレンブルー染色methylene blue stainメチレンブルー染色（methylene blue stain）methylene blue stain（メチレンブルー染色） | 真菌細胞が青色に染まる |
| India ink（墨汁）染色 | 髄液中のCryptococcusの検出に用いる |
血清学的・分子生物学的診断
- 血清中の抗体（Ab）または抗原（Ag）価の測定が診断に有用なことがある
- PCR（polymerase chain reaction, ポリメラーゼ連鎖反応polymerase chain reaction, PCRポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction, PCR）polymerase chain reaction, PCR（ポリメラーゼ連鎖反応））により臨床材料中の真菌特異的核酸を検出できる
鑑別用培地
- Chromagar：発色基質を用いた代謝ベースのカンジダ属菌種鑑別培地
- 鳥の種子寒天Cryptococcus種子寒天（Cryptococcus）Cryptococcus（種子寒天）培地：Cryptococcus neoformansのコロニー周囲に褐色の暈輪halo暈輪（halo）halo（暈輪）が現れる
バイオマーカー
血液中の真菌特異的細胞壁成分を検出する手法——迅速だが偽陽性になりうる点に注意。
| 1,3-β-D-グルカンbeta-D-glucanβ-D-グルカン（beta-D-glucan）beta-D-glucan（β-D-グルカン） | ガラクトマンナン抗原Galactomannan Agガラクトマンナン抗原（Galactomannan Ag）Galactomannan Ag（ガラクトマンナン抗原） | |
|---|---|---|
| 由来 | 多くの真菌の細胞壁成分 | Aspergillus細胞壁の主要多糖成分（他菌種にも一部存在） |
| 主な用途 | カンジダ、Aspergillus（他：ニューモシスチス肺炎Pneumocystis pneumoniaニューモシスチス肺炎（Pneumocystis pneumonia）Pneumocystis pneumonia（ニューモシスチス肺炎）（PCP＝Pneumocystis pneumonia）、Histoplasma、Fusarium、Acremonium、皮膚糸状菌dermatophytes皮膚糸状菌（dermatophytes）dermatophytes（皮膚糸状菌）にも陽性化しうる） | Aspergillus（他：Fusarium、Penicillium、Histoplasmaにも陽性化しうる） |
| クリプトコッカス症cryptococcosisクリプトコッカス症（cryptococcosis）cryptococcosis（クリプトコッカス症）・接合菌症zygomycosis接合菌症（zygomycosis）zygomycosis（接合菌症） | ほぼ常に陰性 | — |
| カットオフcut-offカットオフ（cut-off）cut-off（カットオフ） | 陰性(<60 pg/mL)・判定保留equivocal判定保留（equivocal）equivocal（判定保留）(60〜79)・陽性(>80)、感度55〜95%・特異度77〜96% | OD≧0.5を陽性、侵襲性アスペルギルス症invasive aspergillosis侵襲性アスペルギルス症（invasive aspergillosis）invasive aspergillosis（侵襲性アスペルギルス症）（IA）診断で感度82%・特異度81%。陽性的中率positive predictive value陽性的中率（positive predictive value）positive predictive value（陽性的中率）(PPV)<50%、陰性的中率negative predictive value, NPV陰性的中率（negative predictive value, NPV）negative predictive value, NPV（陰性的中率）(NPV)>90% |
| 偽陽性の原因 | 免疫グロブリン静注療法intravenous immunoglobulin, IVIG免疫グロブリン静注療法（intravenous immunoglobulin, IVIG）intravenous immunoglobulin, IVIG（免疫グロブリン静注療法）、静注ペニシリン製剤（アモキシシリン/クラブラン酸clavulanateクラブラン酸（clavulanate）clavulanate（クラブラン酸）など）、セルロースcelluloseセルロース（cellulose）cellulose（セルロース）膜での血液透析hemodialysis, HD血液透析（hemodialysis, HD）hemodialysis, HD（血液透析）、静注ラインのセルロースcelluloseセルロース（cellulose）cellulose（セルロース）フィルターbarrierフィルター（barrier）barrier（フィルター）、ガーゼパッキングpackingパッキング（packing）packing（パッキング）、アルブミン、特定の細菌感染 | ピペラシリンpiperacillinピペラシリン（piperacillin）piperacillin（ピペラシリン）/タゾバクタムtazobactamタゾバクタム（tazobactam）tazobactam（タゾバクタム）・アモキシシリン/クラブラン酸clavulanateクラブラン酸（clavulanate）clavulanate（クラブラン酸）（投与中止後最大5日残存しうる）、IVIG、造血幹細胞移植hematopoietic stem cell transplantation, HSCT造血幹細胞移植（hematopoietic stem cell transplantation, HSCT）hematopoietic stem cell transplantation, HSCT（造血幹細胞移植）後100日以内・消化管粘膜炎mucositis粘膜炎（mucositis）mucositis（粘膜炎）/移植片対宿主病graft-versus-host disease, GVHD移植片対宿主病（graft-versus-host disease, GVHD）graft-versus-host disease, GVHD（移植片対宿主病）に伴う偽陽性、食品汚染、凍結アイスポップ、特定の血液製剤blood components血液製剤（blood components）blood components（血液製剤） |
画像・その他の診断法
| 手法 | 所見 |
|---|---|
| CT検査 | 結節または斑状陰影。halo徴候（結節周囲の淡い陰影）は免疫不全下の侵襲性アスペルギルス症invasive aspergillosis侵襲性アスペルギルス症（invasive aspergillosis）invasive aspergillosis（侵襲性アスペルギルス症）を示唆しうるが、時期により感度が変化する |
| (1,3)-β-D-グルカンbeta-D-glucanβ-D-グルカン（beta-D-glucan）beta-D-glucan（β-D-グルカン）測定 | 陰性的中率negative predictive value, NPV陰性的中率（negative predictive value, NPV）negative predictive value, NPV（陰性的中率）に優れる |
| ガラクトマンナンgalactomannanガラクトマンナン（galactomannan）galactomannan（ガラクトマンナン）測定 | 証明された侵襲性アスペルギルス症invasive aspergillosis侵襲性アスペルギルス症（invasive aspergillosis）invasive aspergillosis（侵襲性アスペルギルス症）で感度0.73・特異度0.81 |
| 真菌DNAのPCR検出 | 侵襲性アスペルギルス症invasive aspergillosis侵襲性アスペルギルス症（invasive aspergillosis）invasive aspergillosis（侵襲性アスペルギルス症）で感度100%（症状出現の中央値2日前から検出可能）、標準化・検証はさらに必要 |
まとめ
- 真菌培養は世代時間generation time世代時間（generation time）generation time（世代時間）が長く、陰性確定に4週間かかるため、サブロー寒天培地Sabouraud agarサブロー寒天培地（Sabouraud agar）Sabouraud agar（サブロー寒天培地）（4%デキストロース、酸性pH、抗菌薬添加antibiotic-supplemented抗菌薬添加（antibiotic-supplemented）antibiotic-supplemented（抗菌薬添加）、必要ならシクロヘキシミドcycloheximideシクロヘキシミド（cycloheximide）cycloheximide（シクロヘキシミド）添加）で25℃・37℃並行培養し二形性を確認する。
- 診断は微生物学的（培養・鏡検）・免疫学的（血清抗体/抗原）・組織病理histopathology組織病理（histopathology）histopathology（組織病理）学的の3本柱で進める。
- 直接鏡検direct microscopic examination直接鏡検（direct microscopic examination）direct microscopic examination（直接鏡検）は最も迅速・低コストな手段で、KOH前処理と各種染色（Calcofluor-White、Giemsa、Gömöri銀染色silver staining銀染色（silver staining）silver staining（銀染色）＝全真菌に最良、Mucicarmine＝莢膜、India ink＝CSF中Cryptococcus）を使い分ける。
- Chromagar（Candida属鑑別）、鳥の種子寒天Cryptococcus種子寒天（Cryptococcus）Cryptococcus（種子寒天）などの鑑別用培地differentiation agar plates鑑別用培地（differentiation agar plates）differentiation agar plates（鑑別用培地）に加え、1,3-β-D-グルカンbeta-D-glucanβ-D-グルカン（beta-D-glucan）beta-D-glucan（β-D-グルカン）とガラクトマンナン抗原Galactomannan Agガラクトマンナン抗原（Galactomannan Ag）Galactomannan Ag（ガラクトマンナン抗原）という2つのバイオマーカーBiomarkersバイオマーカー（Biomarkers）Biomarkers（バイオマーカー）は迅速だが偽陽性の原因を把握grasp把握（grasp）grasp（把握）したうえで解釈する必要がある。
- CT・PCRなどの補助診断を組み合わせ、培養結果blood/culture results培養結果（blood/culture results）blood/culture results（培養結果）を待たずに早期診断early diagnosis早期診断（early diagnosis）early diagnosis（早期診断）・早期治療介入を可能にする。