真菌の培養。真菌感染症の微生物学的診断

🧠 真菌診断は「遅い培養」と「速い直接法 direct method直接法（direct method） direct method（直接法）」の二重構造で読む。 真菌は世代時間 generation time 世代時間（generation time） generation time（世代時間） が長く（培養に最短48時間、陰性確定に4週間）、待っている間に患者は待てないことが多い——だからこそKOHKOH（potassium hydroxide）直接鏡検 direct microscopic examination直接鏡検（direct microscopic examination） direct microscopic examination（直接鏡検）・各種染色・血清抗原・PCRPCR（polymerase chain reaction）という「培養を待たない」手段が並走する。培養は25℃と37℃を並行して行う点も、4/1で学んだ二形性を検出するための工夫である。

真菌培養の基本原則

• 真菌は世代時間generation time 世代時間（generation time）generation time（世代時間） が長く（増殖が遅い）、最短でも48時間かかる
• 陰性の判定は培養4週間を経てから初めて下せる
• 培養は好気条件で行う（真菌はすべて好気性生物）
• 通常、2種類の温度で並行培養し（二形性の検出のため）、非選択培地 selective medium 選択培地（selective medium） selective medium（選択培地） と選択培地 selective medium 選択培地（selective medium） selective medium（選択培地） を併用する
  • 非選択培地 selective medium 選択培地（selective medium） selective medium（選択培地） ：酵母・カビいずれの急速な増殖も許す

サブロー寒天培地

真菌用の標準寒天培地。

• 高濃度のデキストロース（4%）と5〜10%羊血液を含む
• 炭素源としてグルコース、窒素源としてペプトンを含む
• pHは酸性（4〜5）
• 細菌の増殖を抑えるため各種抗菌薬を添加する
• 酵母・カビどちらも本培地上で増殖できる → カビの増殖を抑えたい場合はシクロヘキシミドcycloheximideシクロヘキシミド（cycloheximide）cycloheximide（シクロヘキシミド）を添加する

⚠️ クリプトコッカスCryptococcus クリプトコッカス（Cryptococcus）Cryptococcus（クリプトコッカス） を疑うときはシクロヘキシミド cycloheximide シクロヘキシミド（cycloheximide） cycloheximide（シクロヘキシミド） を入れない。 シクロヘキシミドcycloheximide シクロヘキシミド（cycloheximide）cycloheximide（シクロヘキシミド） はカビの発育を抑える目的で加えるが、Cryptococcus neoformans自体の発育も抑制してしまうため、培養する際はシクロヘキシミド cycloheximide シクロヘキシミド（cycloheximide） cycloheximide（シクロヘキシミド） 無添加のサブロー培地 Sabouraud agar サブロー培地（Sabouraud agar） Sabouraud agar（サブロー培地） を用いる。

その他の培地・手法

• Czapek寒天培地：真菌の培養全般に用いる
• TTC培地：さまざまな菌種が発育できる複合培地
• Rice tween寒天培地：Candida albicansの厚膜胞子 chlamydospore 厚膜胞子（chlamydospore） chlamydospore（厚膜胞子） の観察や、他菌種の胞子形成 sporulation 胞子形成（sporulation） sporulation（胞子形成） 観察用のスライド slide スライド（slide） slide（スライド） 培養作成に有用
• 寒天ベースの溶解遠心法 lysis centrifugation method溶解遠心法（lysis centrifugation method） lysis centrifugation method（溶解遠心法）：酵母・カビ・二形性病原体による真菌血症 fungemia 真菌血症（fungemia） fungemia（真菌血症） の検出に用いる
• 培養は胞子または菌糸断片から開始できる。臨床検体は膿、血液、髄液、喀痰、組織生検tissue biopsy組織生検（tissue biopsy）tissue biopsy（組織生検）、皮膚掻爬 curettage 掻爬（curettage） curettage（掻爬） 検体など。同定は通常顕微鏡的に行う

検体採取

• 検体は無菌的に、または採取部位を適切に清拭・消毒した後に採取する
• 血液、皮膚、口腔、腟、髄液（CSFCSF（cerebrospinal fluid）＝cerebrospinal fluid, 脳脊髄液）から採取可能
• 処理が遅れる場合は4℃で短期間保存すれば生存率 survival 生存率（survival） survival（生存率） は失われない
• 24時間蓄尿24-hour urine collection24時間蓄尿（24-hour urine collection）24-hour urine collection（24時間蓄尿）・蓄痰は有用でない——細菌・真菌の過増殖が起こるため

直接鏡検

• 最も迅速かつ低コストな診断手段の一つで、最適な培養法選択のガイドにもなる
• ネイティブ標本は10〜20%水酸化カリウム（KOH＝potassium hydroxide）溶液で前処理し、宿主組織の蛋白成分を溶かして真菌要素 fungal elements 真菌要素（fungal elements） fungal elements（真菌要素） だけを見やすくする
• Wood灯Wood's lamp Wood灯（Wood's lamp）Wood's lamp（Wood灯） （紫外線）を用いた蛍光観察も行われる

血清学的・分子生物学的診断

• 血清中の抗体（Ab）または抗原（Ag）価の測定が診断に有用なことがある
• PCR（polymerase chain reaction, ポリメラーゼ連鎖反応polymerase chain reaction, PCRポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction, PCR）polymerase chain reaction, PCR（ポリメラーゼ連鎖反応））により臨床材料中の真菌特異的核酸を検出できる
• MALDI-TOF MS（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, マトリックス支援レーザー脱離イオン化matrix-assisted laser desorption/ionization マトリックス支援レーザー脱離イオン化（matrix-assisted laser desorption/ionization）matrix-assisted laser desorption/ionization（マトリックス支援レーザー脱離イオン化） 飛行時間型質量分析 mass spectrometry質量分析（mass spectrometry） mass spectrometry（質量分析））：培養後の菌種同定 species-level identification 菌種同定（species-level identification） species-level identification（菌種同定） 法として酵母では既に日常検査 routine diagnostics 日常検査（routine diagnostics） routine diagnostics（日常検査） に定着しており、二形性真菌（Coccidioides・Histoplasma・Blastomyces・Sporothrix等）や糸状菌への適用も広がっているが、同定精度は搭載データベースの菌種収載状況に左右される¹

鑑別用培地

• Chromagar：発色基質を用いた代謝ベースのカンジダ属菌種鑑別培地
• 鳥の種子寒天 Cryptococcus 種子寒天（Cryptococcus） Cryptococcus（種子寒天） 培地：Cryptococcus neoformansのコロニー周囲に褐色の暈輪 halo暈輪（halo） halo（暈輪）が現れる

バイオマーカー

血液中の真菌特異的細胞壁成分を検出する手法——迅速だが偽陽性になりうる点に注意。

画像・その他の診断法

💡 β-D-グルカンbeta-D-glucan β-D-グルカン（beta-D-glucan）beta-D-glucan（β-D-グルカン） の感度・特異度は対象患者群・カットオフcut-off カットオフ（cut-off）cut-off（カットオフ） で大きく変動する。 侵襲性真菌症invasive fungal disease 侵襲性真菌症（invasive fungal disease）invasive fungal disease（侵襲性真菌症） 全般（Pneumocystis感染を除く）を対象としたメタ解析 Meta-analysis メタ解析（Meta-analysis） Meta-analysis（メタ解析） でのプール感度は76.8%・特異度は85.3%だが、研究間の異質性 heterogeneity 異質性（heterogeneity） heterogeneity（異質性） が大きく、対象疾患target disease対象疾患（target disease）target disease（対象疾患）・カットオフ値cutoff (value) カットオフ値（cutoff (value)）cutoff (value)（カットオフ値） によって数値は大きく変わる³。

まとめ

• 真菌培養fungal culture 真菌培養（fungal culture）fungal culture（真菌培養） は世代時間 generation time 世代時間（generation time） generation time（世代時間） が長く、陰性確定に4週間かかるため、サブロー寒天培地Sabouraud agarサブロー寒天培地（Sabouraud agar）Sabouraud agar（サブロー寒天培地）（4%デキストロース、酸性pH、抗菌薬添加antibiotic-supplemented抗菌薬添加（antibiotic-supplemented）antibiotic-supplemented（抗菌薬添加）、必要ならシクロヘキシミド cycloheximide シクロヘキシミド（cycloheximide） cycloheximide（シクロヘキシミド） 添加）で25℃・37℃並行培養し二形性を確認する。
• 診断は微生物学的（培養・鏡検）・免疫学的（血清抗体/抗原）・組織病理histopathology 組織病理（histopathology）histopathology（組織病理） 学的の3本柱で進める。
• 直接鏡検direct microscopic examination 直接鏡検（direct microscopic examination）direct microscopic examination（直接鏡検） は最も迅速・低コストな手段で、KOH前処理と各種染色（Calcofluor-White、Giemsa、Gömöri銀染色 silver staining 銀染色（silver staining） silver staining（銀染色） ＝全真菌に最良、Mucicarmine＝莢膜、India ink＝CSF中Cryptococcus）を使い分ける。
• Chromagar（Candida属鑑別）、鳥の種子寒天 Cryptococcus 種子寒天（Cryptococcus） Cryptococcus（種子寒天） などの鑑別用培地 differentiation agar plates 鑑別用培地（differentiation agar plates） differentiation agar plates（鑑別用培地） に加え、1,3-β-D-グルカン beta-D-glucan β-D-グルカン（beta-D-glucan） beta-D-glucan（β-D-グルカン） とガラクトマンナン抗原 Galactomannan Ag ガラクトマンナン抗原（Galactomannan Ag） Galactomannan Ag（ガラクトマンナン抗原） という2つのバイオマーカー Biomarkers バイオマーカー（Biomarkers） Biomarkers（バイオマーカー） は迅速だが偽陽性の原因を把握 grasp 把握（grasp） grasp（把握） したうえで解釈する必要がある。
• CT・PCRなどの補助診断を組み合わせ、培養結果blood/culture results 培養結果（blood/culture results）blood/culture results（培養結果） を待たずに早期診断 early diagnosis早期診断（early diagnosis） early diagnosis（早期診断）・早期治療介入を可能にする。